青海省藏羊感染皮蝇蛆调查及其虫种鉴定

朵 红

(青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

皮蝇病是由狂蝇科皮蝇属的牛皮蝇、纹皮蝇和中华皮蝇的幼虫引起的一种慢性寄生虫病。病原皮蝇幼虫(蝇蛆)主要寄生于牦牛、黄牛，偶而寄生于羊、鹿、麝、野牛、马等动物[1-2]。皮蝇幼虫的寄生导致患畜消瘦，幼畜发育迟缓，产乳量下降，皮革质量降低，从而造成严重的经济损失，并直接影响动物生产性能和存活率[3-5]。青海地区牦牛体上寄生的皮蝇虫种为中华皮蝇、牛皮蝇和纹皮蝇混合感染，其中中华皮蝇是牦牛体上寄生的优势虫种[6]。

关于藏羊感染皮蝇蛆的报道较少[7-8]，2008年～2010年我们对青海省藏羊感染皮蝇蛆进行了调查，发现藏羊存在皮蝇蛆感染，并收集一、二期幼虫，为了解感染藏羊的皮蝇蛆与感染牦牛的皮蝇蛆之间的种属关系，我们对青海省感染藏羊和牦牛的皮蝇蛆进行线粒体CO1基因序列的比较研究。

1 材料和方法

1.1 虫株及临床样品 于2008年～2010年3月～5月份在青海省玛沁县、刚察县某种羊场，贵南县随机抽样进行藏羊皮蝇蛆病感染状况调查，调查藏羊476只；在贵南县、海晏县、民和县收集感染牦牛的皮蝇蛆，并以70%酒精固定。根据收集地区分别编号皮蝇海晏株、民和株、藏羊株1(刚察县某羊场)、藏羊株2(果洛)、黄南株、贵南株；另一株为本研究室于1989年在黄南州收集的感染牦牛的皮蝇蛆(70%酒精固定)。

1.2 主要试剂 TIANamp Genomic DNA Kit购自TIAGEN公司；胶回收试剂盒Gel Extraction Kit D2500-01购自兰州维科生物工程有限责任公司；PremixTaq酶、pGEM-T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司；E.coliDH5α为本实验室保存。

1.3 调查方法 对调查的藏羊群逐只进行摸背检查，计数皮蝇瘤胞数，统计瘤胞寄生部位，最后计算藏羊的感染率和感染强度。

1.4 虫体基因组DNA样品提取 将酒精固定的皮蝇蛆除酒精，取皮蝇蛆内容物约10 mg，按TIANamp Genomic DNA Kit说明书提取总DNA。

1.5 引物设计和目的片段PCR扩增 根据文献[9]设计上游引物UEA7(5'-TACAGTTGGAATAGACG TTGATAC-3')和下游引物UEA10(5'-TCCAATGCAC TAATCTGCCATATTA-3')，由Invitrogen公司合成。将提取的基因组总DNA进行线粒体CO1基因片段PCR扩增。反应条件为：94℃4 min；94℃30 s、54℃1 min、72℃1 min，35个循环；72℃10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 PCR产物的纯化回收及目的基因的克隆和测序 按照Gel Extraction Kit试剂盒说明书进行操作，将目的片段与pGEM-T载体连接、转化，筛选阳性克隆，菌液经PCR鉴定，由北京三博远志生物技术有限公司测序。

1.7 进化树及同源性分析 应用DNAStar软件包中的MegA lign软件对所获得的线粒体CO1基因序列进行序列比较，构建分子进化树和基因序列同源性比较。

2 结果

2.1 青海省藏羊感染皮蝇蛆调查结果 共调查藏羊476只，其中14只为阳性，感染率为2.9%，总瘤胞数为27个，平均感染强度为1.9个。其中玛沁县调查藏羊56只，1只为阳性，感染率为1.7%，瘤胞数为1个，平均感染强度为1个；贵南县调查藏羊300只，9只为阳性，感染率为3%，瘤胞数为16个，平均感染强度为1.8个；刚察县某种羊场调查藏羊120只，4只为阳性，感染率为3.3%，瘤胞数为10个，平均感染强度为2.5个。

2.2 目的基因的扩增 采用引物UEA7和UEA10扩增出大小约为690 bp的CO1核苷酸片段，与预期相符(图1)，并绘制系统进化树(图2)。

图1 皮蝇蛆PCR产物电泳图Fig.1 Amplification of CO1 gene from the Hypoderma larvaesisolates by PCR

图2 蝇蛆株线粒体CO1基因片段聚类分析进化树Fig.2 Hypoderma larvaesstrains Mitochondrial CO1 gene tree cluster analysis

同源性比较结果显示：青海省2株感染藏羊的皮蝇蛆与感染牦牛的民和株和黄南株，在线粒体CO1基因片段聚类分析进化树和同源性比较中，与牛皮蝇位于同一个进化分支上，基因片段同源性大于99%，为牛皮蝇；感染牦牛的海晏株和贵南株在线粒体CO1基因片段聚类分析进化树和同源性比较中，与中华皮蝇位于同一个进化分支上，基因片段同源性大于99%，为中华皮蝇；几株皮蝇蛆种内变异率小于1%，种间变异率大于8%。

3 讨论

本研究于2008年～2010年在青海省部分地区调查藏羊感染皮蝇蛆状况，结果显示平均感染率为2.9%，但在调查时未发现感染藏羊的皮蝇幼虫发育到三期幼虫或脱离的现象，认为皮蝇蛆感染藏羊为一种盲途感染，调查中收集的2株感染藏羊的皮蝇蛆均为牛皮蝇。郭仁民报道绵羊黑色羔羊的皮蝇蛆感染率达90%，根据形态学观察认为感染虫种为纹皮蝇[7]。本研究结果与郭仁民等的研究结果存在差异[3-4,7]，这可能与所收集的虫种或研究方法的不同有一定关系。

CO1为线粒体上细胞色素C氧化酶的一个亚单位，其核苷酸序列具有昆虫种属特异性，这一区域是昆虫之间变化最高的区域，充分表明生物线粒体CO1基因核苷酸碱基序列在一定程度上能够反映出科、属、种和株间在进化上的差异性[10]。我们选择线粒体CO1基因上的细胞色素C氧化酶亚单位1，研究青海省感染牦牛和藏羊的几株皮蝇蛆，种内变异率小于1%，种间变异率大于8%。Otranto等对狂蝇科内能引起专性蝇蛆病的18个属种的CO1基因进行了研究，表明皮蝇科种内变异率为0.14%～1.59%，种间变异率为8.4%～16.4%[11]，本研究结果与该结果一致。

此前我们对感染藏羊皮蝇蛆和感染牦牛的中华皮蝇蛆进行了电子显微镜形态学观察，发现两者在形态上稍有差异[12]，而通过序列分析研究进一步证实我们收集的感染藏羊的皮蝇蛆为牛皮蝇蛆。

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