猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

胡军勇，张 倩，王丹丹，涂志勤，胡睿铭，汤细彪，吴 斌*

(1.华中农业大学动物科技学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学动物传染病诊断中心，湖北 武汉 430070；3.农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

猪博卡病毒(Porcine Bocavirus，PBoV)属于细小病毒科、博卡病毒属，为单股线状无囊膜DNA病毒，基因组约5200 bp[1]。到目前为止，博卡病毒属包括：人博卡病毒(HBoV)、牛博卡病毒(BPV)、犬细小病毒(CnMV)、PBoV、大猩猩博卡病毒(GBoV)、黑猩猩博卡病毒(Chimpanzee bocavirus)[2]。博卡病毒首先在发生肺炎的婴幼儿上呼吸道中被发现[1-2]。此外，在儿童急性病毒性腹泻中检测大量到HBoV，阳性率仅次于轮状病毒(Rotavirus)和星状病毒(Astrovirus)[3]。目前已经证实，多种博卡病毒，包括HBoV、BPV、CnMV、GBoV能够感染并且导致宿主发生急性腹泻[3-7]。2009年，Blomstrom等首先在断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)发病猪中发现PBoV[1]。流行病学调查证实，PBoV在患有呼吸系统疾病和PMWS的猪群的检出率显著高于健康猪群的检出率[4-7]。程卫霞等通过不依赖序列的单引物扩增技术(SISPA-PCR)在健康猪群的粪便中检测到PBoV。2010年，Shan等在无临床症状的猪粪便样品中检测到PBoV的广泛存在，阳性率为63.2%[8]。这表明PBoV可以在猪肠道中定殖并散毒。目前，对于PBoV的致病性，感染猪的临床表现，传播机制等所知甚少[2,7,9]。

从2010年底开始，国内一些地区的猪场爆发了腹泻疫情，以新生仔猪最为严重，症状表现为呕吐、水样腹泻、体重下降及严重脱水，10日龄以下的仔猪症状最为严重，许多猪场的腹泻发病率达到100%，哺乳仔猪的死亡率接近100%。目前，对于导致这波腹泻疫情的病原尚无定论。近年来，多种与腹泻相关的新型病毒被发现，其中PBoV在猪群中的高感染率已引起了广泛关注[9-10]。但国内尚无关于PBoV在腹泻疫情中的流行状况的文献报道。

本研究建立了一种快速、敏感的检测PBoV的PCR检测方法，并应用该方法针对湖北、湖南、河南省的不同猪群中采集样品进行PBoV的流行情况调查。为研究PBoV在腹泻中的作用提供了相关的依据。

1 材料和方法

1.1 重组质粒、病毒株、菌株及临床样品 含有PBoV NS1基因的重组质粒(pMD-PBoV-NS1)由华中农业大学动物传染病诊断中心(简称：诊断中心)构建；猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和副猪嗜血杆菌(Hps)由诊断中心保存，并按照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取其基因组；腹泻样品由诊断中心收集保存。按照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取其基因组。

1.2 PCR引物设计及标准阳性对照重组质粒的构建 根据GenBank中PBoV的NS1基因序列(HM053693、HM053694)设计1对引物。上游引物：5'-AGWCCTACGCCATCAGCAGCATC-3'；下游引物：5'-TCCCRCCTGCCAGGGATTGT-3'；预扩增片段大小为482 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从PBoV基因组中扩增NS1基因目的序列；连接到pMD18-T载体中(pMD-PBo V)，转化到DH5α感受态细胞后测序。

1.3 PCR反应条件的优化 PCR扩增体积为50 μL，其中包括：DNA模板4μL， ExTaq1 μL(5 U)，10×PCR 缓冲液 5 μL，上下游引物各 1 μL(10 μM)，dNTP 1 μL，加 ddH2O 至 50 μL，反应条件为：94℃5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，35个循环；72℃7 min。根据以上的基本扩增条件分别对退火温度(52℃～62℃)和引物浓度范围(0.2 μL～2.2 μL)进行优化。

1.4 特异性试验 应用优化的PCR扩增条件分别对提纯的 PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli、S.suis及Hps的基因组模板进行PCR扩增，以验证该方法的特异性。

1.5 敏感性试验 采用重组质粒作为标准阳性对照测试PCR方法的敏感性。通过紫外分光光度计检测重组质粒的OD值并根据公式计算其浓度，重组质粒的浓度为5.34×1011拷贝/μL，将质粒模板分别稀释至10-1～10-10作为模板，按照建立的方法进行PCR扩增。

1.6 PBoV在腹泻疫情中的流行病学调查 从湖北、湖南、河南省的79个规模化猪场采集的248份仔猪腹泻临床样品，取肠道样品200 mg放入2 mL离心管中，剪碎，然后加入1 mL生理盐水，混匀并且匀浆处理5 min。匀浆后将样品离心，6000 r/min离心5 min，4℃，取匀浆好的样品200 μL，参照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取样品总DNA。采用优化的PCR检测方法进行扩增，PCR产物以2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 PBoV在不同猪群中的分布调查 从4个发生腹泻的规模化猪场对不同猪群随机采集粪便样品，并详细记录猪场的流行病学状况。具体采样方案及样品对应的临床症状见表1。应用PCR方法调查不同猪群中PBoV的分布，分析PBoV与和临床腹泻症状的关联。

2 结果

2.1 PCR检测方法反应条件的优化

2.1.1 退火温度优化结果 以含有PBoV NS1基因的重组质粒pMD-PBoV-NS1为模板，通过特异性引物，采用不同的扩增温度进行扩增。其中，在58℃时，扩增效果最佳所以选择58℃作为最适宜退火温度(图1)。PCR扩增产物约500 bp，与预期片段(482 bp)相符。

图1 退火温度优化结果Fig.1 The optimization of annealing temperature

2.1.2 引物浓度优化结果 按照优化的退火温度，采用不同的引物浓度进行PCR扩增，其中在1.0 μL(10 μM)引物时扩增效果最佳(图2)，并选择作为最佳引物用量。

图2 引物用量优化结果Fig.2 The optimization of primer concentration

2.1.3 PCR最终反应体系 cDNA模板4 μL，Ex-Taq1 μL，10×PCR 缓冲液 5 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，加 ddH2O 至 50 μL。反应条件为：94℃5 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃ 60 s，35个循环；72℃7 min。

2.2 特异性试验结果 应用建立的检测方法分别对PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli、S.suis及Hps的基因组DNA进行检测。结果只能从PBoV阳性样品中扩增出相应大小的片段，其他病毒样品均无扩增片段(图3)。

图3 特异性试验结果Fig.3 The specific test of the PCR assay

2.3 敏感性试验结果 将重组质粒分别稀释为10-1～10-10作为模板，均能够扩增出目的条带，但亮度随着稀释倍数的增加而递减，并且最低检出DNA的量为213.6拷贝 (图4)。

图4 敏感性试验结果Fig.4 The sensitivity test of the PCR assay

2.4 临床腹泻样品检测结果 从湖北、湖南、河南省79个规模化猪场采集的248份仔猪腹泻样品，应用PCR方法检测PBoV，结果172份样品为阳性，阳性率为69.35%，PBoV阳性的猪场数为67个，阳性率为84.81%。

2.5 PBoV感染在不同猪群中的分布调查 对4个发生腹泻的规模化猪场的不同猪群随机采样。应用PCR方法检测不同猪群中PBoV的分布，结果见表1。共采集188份样品，其中腹泻的猪有119头。检测结果显示PBoV阳性的样品有121份。在这121份阳性样品中，共有88份样品对应的猪发生腹泻。因此，所有样品的PBoV阳性率为64.36%(121/188)，其中腹泻猪的PBoV阳性率为88/119(73.95%)，非腹泻猪的PBoV阳性率为33/69(47.83%)。根据表1的结果可以发现PBoV与猪场的腹泻症状有比较一致的对应关系。

表1 4个规模化猪场PBoV阳性率及腹泻发病情况Table 1 PBoV positive rates in various pig groups with or without diarrhea

3 讨论

国内一些地区自2010年底开始，许多猪场发生仔猪腹泻疫情，而且持续不断，疫情波及全国。这次腹泻疫情的发病率、死亡率和持续时间远超往年的平均水平。目前对于导致这次腹泻疫情的病原尚无定论。有文献报道，在发生腹泻的猪群中流行性腹泻病毒的阳性率高达82.0%，相反其他常见腹泻类病毒，如猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒的阳性率则要低很多[11-12]。由此推测，猪流行性腹泻病毒很有可能在这次腹泻疫情中起到极其重要作用；但并不能排除其他病原混合感染，协同感染的可能。目前已经证实，多种博卡病毒，包括HBoV、BPV、Cn-MV、GBoV能够感染并且导致宿主发生急性腹泻[11-12]。但对于PBoV是否是导致腹泻的病原仍然有争议[7,13-14]。本研究根据PBoV的NS1基因序列设计了简并性引物，并建立了PBoV PCR检测方法。通过优化反应条件和反应程序，PBoV PCR检测方法的最低检出量为213.6拷贝，而且具有良好特异性；在248份临床样品中也没有出现任何非特异性扩增的杂带。结果表明本研究建立的PCR检测方法具有良好的稳定性、特异性、敏感性；该方法可以用于临床诊断和流行病学调查提供了有力的支持。

流行病学调查的结果显示，在248份腹泻样品中，PBoV的阳性率达到69.35%，表明在发生腹泻猪的肠道内PBoV的感染非常普遍。在此基础上，我们又深入调查了PBoV在各个猪群中的分布，结果显示在非腹泻猪中PBoV的阳性率只有48.73%，而在发生腹泻的猪群中PBoV的阳性率高达73.95%，显著高于非腹泄猪群。PBoV在新生仔猪中的阳性率最高，其次是种猪和育肥猪；保育猪的阳性率最低，这个分布与这次腹泻疫情高发猪群的分布基本一致，但该结果与Zhai等的结果相反[14]。Zhai的样品采集专门针对的是PMWS，而PMWS发生在断奶仔猪群，而我们的检测针对的是腹泻疫情，而腹泻疫情往往集中发生在新生仔猪和母猪。从这个角度分析，PBoV集中分布于发病群体中。因此，可以推断PBoV与目前的腹泻疫情有一定的相关性。但目前的数据不足以证明PBoV是否为原发性病原，或者起到协同感染的作用。还需要进一步的病毒分离和病例复制等方法提供直接的病原学证据。目前这项工作正在进行中。

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