基于抗多效唑单克隆抗体的酶联免疫吸附方法检测水果中的多效唑

欧阳秋丽， 万益群*，2

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.江西省现代分析科学重点实验室，江西南昌 330031)

多效唑是一种抑制类的植物生长调节剂，能够延缓植物生长、抑制茎杆伸长、改善果品品质，提高其产量，因此被广泛应用于农业生产过程中[1 - 5]。然而，多效唑与其它农药一样，如若超过一定剂量，将会对人体健康造成一定危害[6]。多效唑在土壤中易被吸附，其残留物会污染附近的水体，进而可能危及人类和动物的健康，并影响土壤微生物的活动[7]。研究发现，经假单胞杆菌作用96 h后，多效唑的降解产物会产生致突变性[8,9]。另有研究表明，一定剂量的多效唑对动物雄性生殖器官有损伤，子代体重和繁殖指数降低，肝脏受损，有可能是致癌物质，且多效唑粉剂对皮肤和眼睛有轻微至中等程度的刺激作用[10]。为此，许多国家和地区对多效唑的最大残留制定了一系列标准。如日本规定梨、梅、油桃、杏仁中多效唑的最大残留量为500 ng/mL；我国食品安全标准(GB 2763-2014)中规定，食品中多效唑残留量：稻谷、小麦、油菜籽、花生仁、苹果均为500 ng/mL。因此，开展食品中多效唑残留快速检测新技术研究，对食品安全生产、现场监督都具有十分重要的现实意义。

目前，多效唑的检测方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用及液相色谱-质谱联用等[11 - 13]。这些方法精密度和准确度都较高，但检测成本高、样品前处理复杂，并需要专业的技术人员操作，且不适合现场快速检测。免疫分析法是基于抗原抗体的高度特异性结合，因此具有很高的选择性和灵敏度[14 - 16]。与色谱等分析技术相比，免疫分析法样品前处理简单、样品用量少，适用于大批量样品的现场快速检测[17 - 19]。刘香香等人建立了抗多效唑多克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附法(Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ic -ELISA)，该方法选择性好、灵敏度较高，适用于大批量样品的现场检测[20]。但多克隆抗体的制备均一性较差，背景干扰大，且有时存在交叉反应。相比于多克隆抗体，基于杂交瘤细胞融合技术的单克隆抗体具有很高的特异性，可低成本、连续生产性能一致的抗体。长期以来，小分子抗原免疫分析体系的灵敏度主要依赖于所获单抗的亲和力性能，然而抗体亲和力的定向提升目前仍是世界性的难题。本研究在获得多效唑单克隆抗体的基础上，通过检测抗原改造的方式来提升免疫分析体系的灵敏度，应用本实验室刘香香等[21]制备的抗多效唑单抗，基于琥珀酸酐法和4-(溴甲基)-苯甲酸法制备了分别具有4个碳和8个碳原子连接臂的多效唑检测抗原，结果显示基于8个碳原子连接臂多效唑检测抗原的免疫分析体系的灵敏度提升了6倍，为提高多效唑免疫分析体系的灵敏度提供了一种新的策略。在此基础上，通过反应条件的优化，构建了多效唑的酶联免疫吸附(ELISA)分析新方法，并用于水果中多效唑的快速检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

96孔酶标板(深圳金灿华公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器公司)；酶标仪(Thermo/芬兰Labsystems公司)；37 ℃恒温孵育箱(日本，SANYO)。

多效唑、烯效唑、烯唑醇、己唑醇均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、羊抗鼠IgG -HRP酶标二抗均购自sigma-aldrich西格玛奥德里奇(中国)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)，N,N′-二环己基碳酰亚胺(N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)购自北京百灵威科技有限公司。水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制10×磷酸盐缓冲液(PBS，0.1 mol/L，pH=7.4):NaCl 80 g、KCl 2 g、KH2PO42 g、Na2HPO4·12 H2O 29 g、蒸馏水定容至1 000 mL；1×PBS(0.01 mol/L，pH=7.4):10×PBS稀释10倍；PBST:10×PBS含0.05% Tween-20；碳酸盐缓冲液(CBS，0.05 mol/L，pH=9.6):1.59 g Na2CO3、2.93 g NaHCO3、蒸馏水定容至1 000 mL；TMB显色液：A液：0.018 g乙二胺四乙酸二钠、0.105 g柠檬酸，定容至30 mL，加入20 mL丙酮溶液(含0.025 g TMB)；B液：0.5 g过氧化脲、2.45 g NaAc·3 H2O、3.0 mL冰HAc，定容至500 mL。使用时A、B液等体积混合。

1.2.2 检测抗原的制备第一种包被抗原通过琥珀酸酐法制备多效唑半抗原，再采用EDC法使半抗原与OVA偶联，制备多效唑全抗原，连接臂长度为4个碳原子，合成路线如图1。

图1 琥珀酸酐法合成多效唑全抗原技术路线Fig.1 Preparation of paclobutrazol artificial antigen by succinic anhydride method

第二种包被抗原通过4-(溴甲基)-苯甲酸法制备多效唑半抗原，再采用DCC法使半抗原与BSA偶联，制备多效唑全抗原，连接臂长度为8个碳原子，合成路线如图2。

图2 4-(溴甲基)-苯甲酸法制备多效唑全抗原技术路线Fig.2 Preparation ofpaclobutrazol artificial antigen by 4-(bromomethyl)-benzoic acid method

1.2.3 棋盘滴定法验证包被抗原与抗体的亲和性能采用棋盘滴定法分析包被抗原与抗体的亲和性能，具体实验过程如下：(1)包被：选择所制备的人工抗原为检测原包被96孔酶标板，用1×PBS配制成4个浓度(8、6、4、2 μg/mL)，每个浓度包被一行，每孔100 μL，再用1 μg/mL的BSA与OVA作为为阴性对照，于37 ℃温育2 h。(2)封闭：倒掉包被液，PBST洗板三次后，用5%脱脂牛奶封闭板条，每孔300 μL，于37 ℃温育0.5 h。(3)加单抗：倒掉封闭液，PBST洗板三次，用1×PBS将腹水做稀释(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000)，以MT2 1∶4 000、MB 1∶4 000、FC 1∶4 000为阴性血清对照，并设空白对照，每孔100 μL，于37 ℃温育0.5 h。(4)加二抗：倒掉板内液体，PBST洗板三次，每孔加入100 μL 1∶5 000羊抗鼠IgG -HRP酶标二抗，于37 ℃温育0.5 h。(5)显色：PBST洗板三次，将A、B显色液等体积混合，每孔加入100 μL，于37 ℃显色7 min。(6)终止：每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止显色。在450 nm波长处用酶标仪读取OD值。选取OD450数值为0.8～1.5时的抗原浓度为最佳抗原包被浓度，对应的抗体稀释度为抗体效价。

2 结果与讨论

2.1 基于不同检测抗原的多效唑免疫分析性能

应用基于琥珀酸酐法合成的检测抗原包被96孔酶标板，操作同“1.2.3”部分，结果见表1。从表1可看出，当包被浓度为6 μg/mL时，效果较好，抗体效价为32 000。

表1 基于琥珀酸酐法合成包被抗原的ELISA棋盘测定结果Table 1 ELISA checkerboard assay for coated antigen based on succinic anhydride method

采用ic -ELISA方法测定基于琥珀酸酐法合成包被抗原的免疫分析体系的灵敏度。选用棋盘滴定方法确定的最佳工作浓度，同时每孔分别加入50 μL的0、400、800、1 200 、1 600、2 000、2 400 ng/mL标准品溶液(溶于10%甲醇-PBS中)，及50 μL的抗体(取效价测定时OD450为0.8～1.5左右的稀释度的2倍)做ic -ELISA，同时设置空白对照，其他操作同棋盘测定法，检测OD450。以标准品的浓度为横坐标，B/B0值为纵坐标绘制标准曲线，由此可得基于琥珀酸酐法合成包被抗原的ic-ELISA的Ic50值为505.2 ng/mL。

采用基于4-(溴甲基)-苯甲酸法合成的检测原包被96孔酶标板，其余操作同第一种检测原。结果表明，当检测原浓度为0.4 μg/mL时，抗体效价为1∶160 000，Ic50值为78.5 ng/mL。由此可见，通过4-(溴甲基)-苯甲酸法制备多效唑半抗原，再采用DCC法使半抗原与BSA偶联制备的人工抗原为检测原时，所建立的ic-ELISA体系灵敏度更高。这可能是该检测原与免疫原结构差别更大，从而降低了检测原与抗体的结合，使得抗体与抗原的特异性结合增加，从而提高了该ic -ELISA体系的灵敏度。

2.2 基于抗多效唑单克隆抗体的多效唑ELISA方法的建立

2.2.1 分析条件的优化分别对检测抗原包被液、包被条件、离子强度、缓冲液pH、标准品稀释液与竞争模式等实验条件进行了优化。

采用所选择的检测原包被96孔酶标板，分别用1×CBS、1×PBS作为包被液与抗体稀释液做竞争反应，测得抗体在该条件下Ic50分别为133.6 ng/mL和78.5 ng/mL，表明PBS比CBS更适宜该抗体与抗原的特异性反应，故选择1×PBS为包被液。

选择37 ℃包被2 h、3 h与4 ℃包被过夜，测得的Ic50分别为78.0 ng/mL、84.4 ng/mL、97.5 ng/mL。结果表明，温育比4 ℃包被过夜的灵敏度更高，且随着温育时间的延长，其OD值会有所上升，但是Ic50也会有所提高。最终选择37 ℃包被2 h。

基于以上的优化，缓冲液离子强度分别选择1×PBS、5×PBS、10×PBS，其Ic50分别为78.5 ng/mL、98.6 ng/mL、80.1 ng/mL，虽然10×PBS与1×PBS的半抑制浓度相差不大，但是离子强度过大，会影响蛋白原性，从而影响特异性结合，故选择1×PBS。

选择不同pH(5.5、6.5、7.4、8.5)的1×PBS进行实验，测得Ic50分别为73.4 ng/mL、82.9 ng/mL、78.5 ng/mL、76.2 ng/mL。但是，相同稀释度的抗体在pH=5.5、8.5的OD值均较低，由此可知该抗体在中性条件下更稳定，故选择1×PBS(pH=7.4)作为反应缓冲液。

分别以板外竞争与板内竞争两种模式进行ic-ELISA反应。板外竞争，即将抗体与标准品各50 μL，在封闭的酶标板中反应30 min，再将反应液转移至用检测原包被的板条中反应30 min。结果表明，板外竞争Ic50=69.2 ng/mL、板内竞争Ic50=78.5 ng/mL，二者Ic50相差不大，且板外竞争中抗体与标准品转移过程中会造成损失，导致最终OD值偏小，故选择板内竞争模式。

图3 最优条件下的间接竞争标准曲线Fig.3 Indirect competition standard curve under optimal conditions

分别选择5%甲醇-PBS、10%甲醇-PBS、15%甲醇-PBS和20%甲醇-PBS为标准品的稀释液，其Ic50值分别为71.8 ng/mL、78.5 ng/mL、54.0 ng/mL和87.3 ng/mL。结果表明，甲醇浓度过低或者过高都会使Ic50值偏高，这是由于当甲醇浓度过低时，标准品溶解不完全，但是当甲醇浓度过高时，会影响蛋白原性。最终选择15%甲醇-PBS为标准品稀释液。

在上述优化的实验条件下，以结合率B/B0(y)为纵坐标、浓度(c)为横坐标，绘制间接竞争标准曲线，结果见图3。标准曲线为：y=-21.07lnc+134.19，线性相关系数为0.9923，Ic50为54 ng/mL，检测限Ic20：13.4 ng/mL～Ic80：212.7 ng/mL。

2.2.2 交叉反应分别以多效唑的类似物烯效唑、烯唑醇代替多效唑，浓度均为4 000、2 000、1 000、500、250、125 ng/mL的梯度，ic-ELISA测定它们的Ic50，并按公式计算交叉反应率(CR(%)):CR(%)=Ic50(PAC)/Ic50(类似物)×100%，结果见表2。结果表明除烯效唑有极小的交叉反应外，其余类似物几乎不与抗体反应。

2.2.3 样品测定准确称取10 g左右匀浆好的食品(苹果、脐橙)样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，于迷你振荡器上振荡2 min。然后加入5 g无水MgSO4，振荡2 min后4 000 r/min离心10 min，再将其上清液转移到浓缩瓶中，氮气吹干。残留物加1 mL甲醇溶解，取100 μL用PBS稀释成15%甲醇-PBS进行ic -ELISA测定。在上述样品中分别添加4个不同水平的多效唑标准品进行加标回收实验，每个水平平行测定3次，结果见表3。由表3可知，所分析的样品中未检测出多效唑残留，苹果、脐橙样品加标回收率分别为83.2%～96.4%、88.9%～94.6%，表明所建立的方法能够满足实际样品分析要求。

表2 多效唑及其类似物的交叉反应Table 2 Cross-reactivity of the paclobutrazol and its analogues

表3 苹果、脐橙中多效唑加标回收结果(n=3)Table 3 Recovery results of paclobutrazol in apple and navel orange samples(n=3)

3 结论

在获得抗多效唑单克隆抗体的基础上，选择4-(溴甲基)-苯甲酸法与DCC法制备含8个碳原子连接臂的全抗原作为包被抗原，异源检测拓宽了检测原的选择性。通过包被液、包被时间、缓冲液离子强度、pH、竞争模式和标准品稀释液中有机溶液含量等反应条件的优化，建立了基于单克隆抗体的多效唑的ic-ELISA分析新方法。该方法的Ic50=54 ng/mL，低于国家限量标准500 ng/mL，与多效唑的结构类似物不存在交叉反应，具有较好的特异性。在苹果和脐橙中的加标回收实验中显示出较好的方法学准确度，所构建的方法可应用于水果中多效唑的快速检测。