基于壳聚糖-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)-2-(苄基脲)手性固定相的制备及其分离性能

蔡明兰， 熊金辉， 郝菊芳， 何保江， 柏正武*

(1.武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430205；2.中国烟草总公司职工进修学院，河南郑州 450008；3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南郑州 450001)

手性药物对映体在人体内的药理和生理活性方面往往存在显著的差异，如一个对映体能治疗疾病，而另一个对映体可能会对人体有毒，所以手性化合物(尤其是手性药物)的对映体分离非常重要[1]。目前基于使用手性固定相(Chiral Stationary Phase，CSP)的高效液相色谱(High-performance Liquid Chromatography，HPLC)法已成为对映体分离分析最有效的方法之一[2,3]。在现有的手性固定相中，以纤维素和直链淀粉衍生物制备的涂敷型手性固定相分离性能最佳，但这些手性固定相在正相条件下对流动相的耐受性不强，其流动相的适用范围受到限制[4 - 6]。因此，研制手性分离性能强且对流动相耐受性好的固定相是手性分离领域中的一项主要工作。

甲壳素和壳聚糖都曾用来制备CSP[7 - 9]，因其衍生物在绝大数有机溶剂中难以溶解，所制得的CSP对流动相有良好的耐受性能。但至今为止对壳聚糖衍生物手性固定相的研究仍不够全面、深入，特别在构效关系方面尤其如此。壳聚糖的2位上连接的是氨基，3位和6位上连接的是羟基，氨基和羟基对酸酐及酰氯的反应活性不同，可以对这两种基团进行选择性的修饰[10]，合成出各种不同结构的衍生物。现已有一些酰基化壳聚糖衍生物CSP的报道[11,12]，但对脲基化壳聚糖衍生物CSP的报道仍很少。

为发现分离性能好的脲基化壳聚糖衍生物CSP，以及研究其构效关系，本文以壳聚糖为手性源，将其2位上的氨基转化为苄基脲，再用4-甲基苯基异氰酸酯和4-氯苯基异氰酸酯分别修饰脲基化壳聚糖3位和6位上的羟基，合成出壳聚糖-3，6-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-2-(苄基脲)和壳聚糖-3，6-二(4-氯-苯基氨基甲酸酯)-2-(苄基脲)。以上述两种壳聚糖衍生物为手性选择体，制备两种相应的固定相，通过分析检测，比较这两种固定相的手性分离性能，考察壳聚糖衍生物中的甲基和氯对分离性能的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，配备W600泵、W717自动进样器、996二极管阵列检测器和Empower色谱工作站；PerkinElmer FT-IR红外光谱仪(美国，PE公司)；Bruker AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振仪(瑞士，Bruker公司)；Alltech 1666色谱柱填充泵(美国，Alltech公司)。

壳聚糖按文献方法[13]制备(脱乙酰度>99%，粘均分子量为1.4×105)。7 μm球形大孔硅胶(日本Daiso公司)；甲壳素(潍坊海之源生物制品有限公司)；N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲酸乙酯、甲醇、LiCl、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)和用作色谱流动相的有机溶剂(国药集团化学试剂有限公司)，在使用前DMAc经分子筛(4 Å)干燥三次，LiCl在马弗炉中于300 ℃下干燥3 h；4-甲基苯基异氰酸酯、4-氯苯基异氰酸酯(濮阳市宏达圣导新材料有限公司)。

1.2 手性选择体的制备

以氯甲酸乙酯代替氯甲酸甲酯，按文献方法[14]合成壳聚糖苄基脲。将2.0 g LiCl和20 mL DMAc相混合，加热至80 ℃使LiCl完全溶解。向此溶液中加入1.5 g(5.14 mmol)壳聚糖苄基脲，搅拌至固体完全溶解。再向上述壳聚糖苄基脲溶液中加入催化量的DMAP及3.64 g(25.68 mmol)4-甲基苯基异氰酸酯，在90 ℃下反应30 h。反应结束后，趁热将反应混合液滴加至200 mL甲醇中得到沉淀物，过滤，干燥。将粗产物溶于20 mL DMF中，再在150 mL甲醇中重沉淀，过滤，干燥。如此重复若干次，直到收集到的滤液经薄层色谱检测无紫外吸收为止，干燥至恒重，得到壳聚糖-3,6-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-2-(苄基脲)，即CS1，产率为68%。

1H NMR(600 MHz，DMSO-d6，90 ℃，δ/ppm)：9.29～8.59(2H，Ph-NH-CO2)，7.52～6.72(13H，Ph-H)，6.40～5.52(2H，-NH-CO-NH-)，5.17～3.27(9H，氨基葡萄糖骨架H，Ph-CH2)，2.36～1.90(6H，Ph-CH3)；IR(KBr，cm-1)υ：3 389～3 318(-NH-)；3 059，2 924，2 863(-C-H)；1 714，1 661，1 528，1 451，1 406(-OCONH-，-CONH-)；1 602(-Ph)，1 055(C-O-C)。

按以上制备方法，用4-氯苯基异氰酸酯修饰壳聚糖苄基脲，得到壳聚糖-3,6-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-2-(苄基脲)，即CS2，产率为72%。

1H NMR(600 MHz，DMSO-d6，90 ℃，δ/ppm)：9.61～8.92(2H，Ph-NH-CO2)，7.72～6.68(13H，Ph-H)，6.40～5.49(2H，-NH-CO-NH-)，5.17～3.21(9H，氨基葡萄糖骨架H，Ph-CH2)；IR(KBr，cm-1)υ：3 397～3 326(-NH-)；3 112，3 061，2 936，2 877(-C-H)；1 720，1 661，1 534，1 497(-OCONH-，-CONH-)；1 604(-Ph)；1 059(C-O-C)。

1.3 手性固定相的制备和填装

参照文献中的方法制备氨丙基硅胶[15]。将0.65 g的CS1溶解在30 mL DMF中，得到CS1溶液。取10 mL此溶液，向其中加入2.60 g 3-氨基丙基硅胶，超声，使其混合均匀，在减压及45～50 ℃下用旋转蒸发仪缓慢均匀地蒸出DMF。每次使用10 mL CS1溶液，重复两次上述涂敷过程。最后将固体真空干燥至恒重，得到白色细粉末，即为CSP1。按上述涂敷方法，制得CSP2。在涂敷中，CS1和CS2的投料量均为20%。用20 mL正己烷/异丙醇(90/10，V/V)将约为3.0 g CSP1或CSP2制备成匀浆液，用正己烷为顶替液，在约为34.5 MPa压力下，将匀浆液压入空的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.)内，制得填充有CSP1或CSP2的手性色谱柱。

1.4 分离性能的评价

在本文的所有检测中，柱温箱的温度均设置为25 ℃，流动相的流速均为1 mL/min。以正己烷/异丙醇(90/10,V/V)为流动相，联苯和1，3，5-三(叔丁基)苯为分析物，测定手性色谱柱的柱效和死时间(t0)。以如图1所示手性化合物为分析物，在正己烷/异丙醇(90/10,V/V)、正己烷/乙醇(90/10,V/V)和正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,V/V)三种流动相条件下，测试CSP1和CSP2的分离性能。

色谱参数为：容量因子k=(t-t0)/t0，其中t为手性分析物中的某一对映体或手性分析物(如果没有被手性识别)的保留时间；分配因子α=k2/k1，k1和k2分别为两个对映体的容量因子，当α>1.0时，即发生了手性识别；分离度RS=2(t2-t1)/(w1+w2)，t1和t2分别为第一及第二个被洗脱出来的对映体的保留时间，w1和w2分别为这两个对映体色谱峰的峰宽，当RS≥1.50时，两个对映体达到了基线分离。

图1 手性分析物的结构式Fig.1 Structures of chiral analytes

2 结果与讨论

2.1 CSP1和CSP2的手性分离性能

CSP1和CSP2在三种流动相条件下的分离结果如表1所示。从表1可知，CSP1和CSP2分别识别了14和15种手性分析物的对映体，都基线分离了其中的8种。总的来说，这两种CSP的手性分离性能没有非常大的差别。在CS1和CS2的分子中，CS1的苯环对位上为甲基，而CS2的苯环对位上为氯，它们的结构相似，但又不完全相同，所以，CS1和CS2的高级结构也应该相似，导致其手性分离性能大抵相当。而CS1和CS2高级结构细微的不同又造成CSP1和CSP2在对映体分离特征上仍稍有差别。如有7个手性样品在CSP1和CSP2上均得到了基线分离，其中5个手性样品在CSP1上的分离度比在CSP2上的大；虽然3、5、14号这三个样品在CSP1和CSP2上仅被识别，而5号和14号样品在CSP1上仍有更大的分离度。以上结果表明，CS1和CS2的苯环上连接不同的取代基对固定相的对映体分离有一定的影响。

表1 CSP1和CSP2的手性分离结果Table 1 Enantioseparation results of CSP1 and CSP2

(续表1)

2.2 手性选择体结构对手性分离的影响

对于多糖苯基氨基甲酸酯衍生物来说，极性官能团氨基甲酸酯是发生手性识别最重要的部位，因为该官能团与手性样品的对映体能发生氢键及偶极-偶极相互作用。有文献报道，在苯环上设置给电子或吸电子基会影响多糖苯基氨基甲酸酯衍生物的手性分离[16]。譬如，CS2的苯环上连有吸电子基团氯，通过与苯环的共轭作用，该氯原子能分散氨基甲酸酯中N上的电子云密度，使-NH-C=O中H的酸性增强，继而使CS2与手性样品之间的氢键作用也随之增强，大多数手性样品在CSP2上有更大的容量因子就验证了这一推论。此外，对于多糖衍生物类的CSP，手性分离还受手性选择体高级结构的影响，而多糖衍生物中的取代基又影响手性选择体的高级结构。从图2A可以看出，在正己烷/乙醇(90/10，V/V)中，9号分析物在CSP1上的分离度更大，其原因可能是，与CS2相比，9号样品的一个对映体容易嵌入CS1的螺旋空腔中，使两个对映体有更大的分离度，而CS1螺旋空腔的形状和大小应与苯环上的甲基相关；从图2B可知，在正己烷/乙醇(90/10，V/V)中，CSP2能够基线分离16号样品，而CSP1则不能识别该样品对映体。除了氢键作用外，相信CS2螺旋空腔的形状和大小和16号样品得到基线分离也有关，CS2的高级结构又受到苯环上氯原子的支配。

本文还观察到一些有趣的分离结果：含有脲基结构的1号和15号样品，以及含有卤素原子的5、6和11号样品在CSP1上的分离度均大于在CSP2上的分离度，说明苯环上连接着甲基的CS1更利于含脲基或含卤素手性样品的分离；而含有酰胺官能团的2、3、和8号样品在CSP2上具有更大的分离度。

图2 9号和16号手性样品在CSP 1、CSP 2上的分离色谱图。流动相：正己烷/乙醇(90/10,V/V)Fig.2 Chromatograms of chiral analytes 9 and 16 separated by CSP 1 and CSP 2.Mobile phase:n -hexane/ethanol(90/10,V/V)

3 结论

本文将壳聚糖2位上的氨基选择性地转换为苄基脲，再用4-甲基苯基异氰酸酯和4-氯苯基异氰酸酯修饰壳聚糖苄基脲上的羟基，制得CS1和CS2，并以此制备了相应的CSP。所制得的两种CSP均具有较好的手性识别能力，比较手性样品在这两种CSP上的分离度发现，含甲基的CSP稍比含氯的CSP有更好的手性分离性能。另外，大多数手性样品在含氯原子的CSP上有更大的容量因子。手性样品在两种CSP上有不同的容量因子和不同的分离度与CS1和CS2上所连接的甲基及氯原子有关。