基于金-铜纳米复合粒子修饰的甲硝唑分子印迹传感器的研究

时间：2024-09-03

郭宣利, 王文廉*

(1.中北大学仪器科学与动态测试教育部重点实验室，山西太原 030051； 2.中北大学电子测试技术国家重点实验室，山西太原 030051)

甲硝唑(MNZ)是临床常用的硝基咪唑类抗生素药物，具有抗菌和消炎的作用[1]，由于MNZ具有生长促进剂的作用，可以促进水产品的的生长，致使在水产品饲料中添加时有发生，对人体健康造成危害[2]。当前检测MNZ的方法如色谱法[3]、质谱法[4]和紫外分光光度法[5]存在操作繁琐，时间冗长，成本太高等问题。分子印迹技术是指制备对某一特定目标分子具有特异选择性聚合物的过程。在分子识别、固相萃取、色谱分离等方面得到广泛应用。分子印迹传感器具有高灵敏度和高选择性的优点，便于自动化和现场检测使用，检测成本低，已成为研究热点[6,7]。

目前，分子印迹聚合物(MIPs)的制备方法主要有本体聚合、悬浮聚合、沉淀聚合等[8]。金属纳米颗粒,诸如Au、Pt、Ag、Cu、Ni,已经成为最热门的增加电化学活性的电催化剂[9,10]。Au纳米粒子(Au NPs)与Cu纳米粒子(Cu NPs)较大的比表面积可以有效增加分子的负载量，且可与生物分子良好兼容，用它作为增敏材料可有效提高电化学传感器的灵敏度、稳定性以及生物相容性[11]。与单一的纳米粒子相比，纳米合金粒子的催化特性和生物相容性更加突出，不同纳米粒子虽然相互独立，但纳米合金却不只是两种纳米粒子性能的简单相加。而是在保持各个金属特点的基础上，具有金属间协同作用产生的综合性能[15]。本文采用电沉积法将Au-Cu合金纳米粒子(AuCu NPs)修饰在玻碳电极表面，利用循坏伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)对所修饰的MNZ分子印迹传感器进行电化学表征。结果显示纳米Au-Cu修饰的电极信号更灵敏。通过多次实验优化了实验条件，实现了对MNZ的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极体系(北京众信恒通科技有限公司)：4 mm玻碳电极(GCE)为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt网电极为对电极；WS70-1红外干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)；SY360超声清洗仪(上海宁商超声仪器有限公司)。

甲硝唑(MNZ)、罗硝唑、4-硝基咪唑均购于上海晶纯试剂有限公司，上述三种物质均用甲醇溶解后用于后续实验。邻苯二胺购于Adamas中国(上海)有限公司；HAuCl4、CuSO4购于国药上海化学试剂公司。所用试剂均为分析纯，所有溶液都由高纯水配制。

甲硝唑片(每片含甲硝唑0.2 g)在当地药店购买。

1.2 实验方法

1.2.1 AuCu NPs/GCE的制备将GCE在鹿皮上，分别用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末抛光至光亮的镜面后，在超声波清洗仪中分别用HNO3(1+1)、无水乙醇和高纯水超声清洗3 min,清洗好的电极在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中扫描，直到获得稳定的CV曲线。将电极用氮气吹干后备用。将干燥洁净的电极置于10 mmol/L HAuCl4、5 mmol/L CuSO4与0.5 mol/L H2SO4的混合溶液中进行恒电流沉积。沉积电流为-0.6 mA，沉积时间为900 s，沉积过程中用磁子不断搅拌。随后，在烘箱中烘干，即制得AuCu NPs/GCE。

1.2.2 AuCu NPs/MNZ/GCE的制备将AuCu NPs/GCE放入含0.2 mol/L MNZ和0.4 mol/L邻苯二胺的混合溶液中，在0～0.8 V电位范围内采用CV法，在扫速50 mV/s下扫描40圈进行电聚合，随着扫描的进行，电极表面会镀上一层弱电性MNZ分子印迹聚合物膜，电聚合完成后将电极置于0.3 mol/L的H2SO4溶液中，在100 mV/s的扫速下，于-1～1 V电位范围内用CV法扫描进行洗脱，直到在4.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl的混合溶液进行扫描至氧化还原峰且峰值大小不变，说明MNZ已经从分子印迹膜中洗脱下来。用氮气吹干，备用。

2 结果与讨论

2.1 AuCuNPS/GCE的电化学表征

图1为AuCu NPs/GCE的电化学表征，由于CV曲线峰值电流差距过大，放在同一图中难以分辨最小峰电流的曲线，我们将表征分为A图和B图。图1A为裸GCE与修饰Au NPs后的电极在K3[Fe(CN)6] 溶液中的CV曲线，图1B为镀Au NPs与镀AuCu NPs的电极在K3[Fe(CN)6]溶液中的循环伏安曲线。由图1A可知，Au NPs可以在一定范围内增加传感器的响应电流值。由图1B电流大小可知，纳米合金相比于单一的纳米粒子电流响应更大，因此传感器的灵敏度更高。图1中镀Au NPs电极的制备与制备AuCu NPs电极类似，只是将10 mmol/L HAuCl4、5 mmol/L CuSO4与0.5 mol/L H2SO4的混合溶液中的CuSO4去掉，其余制备方法均相同。

图1 不同电极在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammograms curves of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] solution A:Bare electrode (a) and electrode after plating nano-gold (b);B:Electrode after plating nano-gold (b) and nano-gold-copper alloy(c).

2.2 MNZ甲硝唑在AuCu NPS/GCE上的电化学行为

将制备好的AuCu NPs/MNZ/GCE放入1.0×10-9mol/L的MNZ溶液中孵育10 min后，放入5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中进行DPV扫描，记录其峰值电流。探讨MNZ在修饰电极上的电化学行为，原理是洗脱后带有MNZ分子空穴的分子印迹膜在孵育后被MNZ分子占据，使得电极表面的有效电子转移数目减少，所以电流会减小。通过实验得到结论，MNZ未孵育时和孵育后在裸GCE上的电流相比虽有减小，但减小很微弱，与AuCu NPs/GCE修饰电极相比出现了明显减小的峰值。这可能是因为AuCu NPs/GCE具有良好的导电性、较高的比表面、良好的稳定性，使电极对MNZ的检测更灵敏，所以与裸电极相比，AuCu NPs/GCE修饰电极占据MNZ空穴能力更强，使得电流减小更加明显。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 电沉积电流的优化采用DPV法研究了GCE在-0.8～0.3 mA恒电流下沉积AuCu NPs的效果。结果表明，在-0.6～-0.3 mA范围内峰电流随沉积电流的增加而增大；当沉积电流达到-0.6 mA时，峰电流达到最大，说明沉积效果最好。

2.3.2 电沉积时间的优化采用DPV法研究了GCE修饰AuCu NPs在200～1 200 s之间的效果，得到结果在200～900 s峰电流随着沉积时间的增加而增大，超过900 s后，峰电流随着时间增加而减小，说明900 s时电沉积已经达到饱和。

2.3.3 模板分子与功能单体比例的优化改变模板分子和功能单体比例并对DPV法的峰电流进行检测。结果发现当模板分子与功能单体比例低于1∶2时，响应电流随着比例增加而增大，当模板分子与功能单体比例高于1∶2时，响应电流开始减小。原因可能是模板分子数量变少，功能单体过多，过多的功能单体占据了电极表面，导致形成的分子印迹膜太厚，洗脱不完全，所以结合位点减少，响应电流下降。

2.3.4 电聚合圈数的优化在电聚合时可以通过控制聚合圈数来控制分子印迹膜的厚度，实验结果表明，当电聚合圈数少于40圈时，聚合圈数和响应电流成正比，当电聚合圈数大于40圈时，响应电流开始减少。原因可能是聚合膜厚度增加，模板分子很难洗脱完全，所以响应电流下降。

2.3.5 洗脱液和洗脱液浓度的优化在电极表面电聚合分子印迹聚合物之后，必须进行洗脱实验，才能得到具有模板分子空穴的分子印迹传感器。因此，适当的洗脱剂是成功制得分子印迹膜的关键。可供选择的洗脱剂，包括NaOH、H2SO4、磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7)和KCl。对这些洗脱剂我们逐一进行了实验，记录他们的DPV响应电流，结果表明H2SO4具有最佳的洗脱效果(图2A)。此外，我们对H2SO4的浓度也进行了优化(图2B)，由图我们可以看出，在0.1～0.3 mol/L范围内，电流响应峰值逐渐变大，当H2SO4浓度高于0.3 mol/L时，电流响应开始下降，所以，最佳的洗脱剂是浓度为0.3 mol/L的H2SO4溶液。

图2 AuCu NPs/MNZ/GCE的DPV峰电流与洗脱剂种类(A)和洗脱剂浓度(B)关系曲线Fig.2 Curves of the DPV peak current of AuCu NPs/MNZ/GCE as a function of the eluent species(A) and eluent concentration(B)

图3 AuCu NPs/MNZ/GCE的DPV峰电流与洗脱圈数关系曲线Fig.3 Curve of DPV peak current as a function of the elution cycles of AuCu NPs/MNZ/GCE

2.3.6 洗脱时间的优化由图3中可以看出，洗脱圈数在15～30圈时，响应电流随着洗脱圈数增加而增大，但洗脱圈数继续增加时，响应电流就会减小。这可能是由于洗脱过度，分子印迹膜被破坏导致电流降低。

2.4 标准曲线与检出限

在优化后的实验条件下，将AuCu NPs/GCE置于不同浓度MNZ溶液中孵育10 min后，放入4.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中进行DPV扫描，记录峰值电流，结果如图4(A)所示。随着MNZ浓度增大，DPV响应电流减小，并且DPV响应在4.0×10-10～8.0×10-7mol/L浓度范围内成良好的线性关系(图4(B))，线性方程为：IP=-3.85119lgc-24.70427(IP：10-5A，c:mol/L)，线性相关系数R2=0.99438。当信噪比(S/N)为3时，检出限为3.25×10-12mol/L。

图4 (A)分子印迹电化学传感器在不同浓度的MNZ溶液中孵育10 min后的DPV曲线；(B)MNZ浓度与峰电流的关系拟合曲线Fig.4 (A)DPV curves of molecularly imprinted electrochemical sensor after incubation for 10 min in different concentrations of MNZ solution(a:4.0×10-10,b:4.0×10-9,c:8.0×10-9,d:4.0×10-8,e:8.0×10-8,f:4.0×10-7,g:8.0×10-7 mol/L);(B)Fitting curve of relationship between MNZ concentration and peak current

将制得的传感器与已知的其他检测MNZ的传感器进行比。由表1可以看出，与其他检测MNZ的电极相比，AuCu NPs/MNZ/GCE具有更宽的线性范围和更低的检出限，可以看出纳米合金复合物与其他单一修饰材料相比更有优势。

表1 AuCu NPs/MNZ/GCE电极与已报道其他电极检测MNZ的比较Table 1 Comparison of AuCu NPs/MNZ/GCE with other electrodes reported for MNZ

图5 (A)AuCu NPs/MNZ/GCE在不同溶液中的DPV曲线；(B)AuCu NPs/MNZ/GCE在连续5 d的DPV峰电流曲线Fig.5 (A) DPV curves of AuCu NPs/MNZ/GCE in different solutions(a:blank solution,b:4-nitroimidazole,c:ronidazole;d:dimetridazole,e:metronidazole)；(B) Peak current of DPV of AuCu NPs/MNZ/GCE for five consecutive days

2.5 识别特异性和重复性

用制得的MIPs/AuCu NPs分子印迹传感器检测与MNZ结构相似的物质(罗硝唑、4-硝基咪唑、二甲基咪唑)来确定所制备传感器的识别性。如图5(A)所示，曲线a为洗脱后未经孵育电极的DPV响应曲线，曲线b～e分别为在4-硝基咪唑、罗硝唑、二甲基咪唑和MNZ的溶液中孵育10 min后的DPV响应曲线。检测原理与前面提到的检测MNZ在修饰电极上的电化学行为原理相同，与未孵育电极相比电流响应差值越大，识别性越好。从图中可以看出，与未孵育相比，传感器在MNZ溶液中孵育10 min，峰值电流差值Δ1远大于其他差值Δ2、Δ3、Δ4，这说明MNZ可以被传感器的空穴很好地识别，而将传感器放入其他三种溶液中，峰值电流几乎不发生变化，表明制得的传感器有良好的识别性。

用制得的传感器连续5 d利用DPV法扫描测定相同浓度的MNZ，得到图5(B)，结果电流响应没有明显的变化，相对标准偏差(RSD)<3%，说明所制备的传感器具有良好的稳定性。

图6 AuCu NPs/MNZ/GCE在1.0×10-9 mol/L的MNZ中(a)和1.0×10-9 mol/L的MNZ与1.0×10-7 mol/L的其他物质混合后的溶液中(b)的DPV曲线Fig.6 DPV curve of AuCu NPs/MNZ/GCE in 1.0×10-9 mol/L MNZ(a) and 1.0×10-9 mol/L MNZ mixed with 1.0×10-7 mol/L other substances(b)

2.6 抗干扰性

采用AuCu NPs/GCE进一步考察在实际样品中主要干扰物质的电流响应，来探究所制备传感器的抗干扰能力。由于我们选用的实际样品(甲硝唑片)中淀粉、葡萄糖、蔗糖和MNZ为主要共存物质，因此配制1.0×10-9mol/L MNZ溶液，加入100倍浓度的淀粉、葡萄糖、蔗糖混合后进行DPV扫描，结果见图6。结果表明，与单独检测MNZ溶液(a)相比，混合溶液(b)电流响应几乎没有改变。说明AuCu NPs/GCE在实际样品检测中有良好的抗干扰能力。

2.7 实际样品分析

以甲硝唑片(每片含0.2 g甲硝唑)作为样品，考察制备的传感器实际可用性。取10片样品研磨后用pH=6.6的PBS逐步稀释成50 mL浓度为2.0×10-9mol/L的样品溶液，之后分别取10 mL样品溶液加入一定量的MNZ标准溶液进行加标回收率测定，结果如表2。经计算，回收率为96%～107%。表明该分子印迹传感器具有良好的实际样品检测能力，可以对复杂样品中的甲硝唑进行定量分析。

表2 实际样品中甲硝唑回收率测定结果Table 2 Recovery of metronidazole in actual samples