展青霉素分子印迹聚合物的合成表征及其在苹果汁分析中的应用

闫士华， 谢子奇， 张露晓， 罗云敬

(北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室,北京 100124)

展青霉素(Patulin，PAT)是常见的真菌毒素之一,其毒性极强且分布范围广[1]，在世界各地的多种食品中均不同程度检测到PAT[2,3]，于霉变的水果中尤其常见，严重威胁着人们的健康。体外实验表明[4,5]，PAT可诱导多种菌株的基因突变，对体外培养的细胞亦有DNA损伤作用；动物实验研究也发现PAT对多种器官有明显的毒性[6,7]。我国国家标准(GB 2761-2017)《食品中真菌毒素限量》规定苹果汁等食品中PAT限量为50 μg/kg[8]。由于PAT的高毒性，各国学者对其灵敏和准确的检测方法给予高度关注，但是PAT检测仍然有一些问题存在：微乳液电动色谱法准确度较低[9]、酶联免疫法操作繁琐[10]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)成本高昂[11]等。高效液相色谱(HPLC)结合紫外法检测食品中的PAT，因简单且准确于2016年纳入中国食品安全国家标准[12]。然而，利用HPLC法检测实际样品中的PAT时，5-羟甲基糠醛(5-HMF)因结构及化学性质类似[13]，对其检测的准确性和灵敏性造成影响，更何况实际样品中组分较多，目标分析物极易被干扰。

近年来，食品中PAT检测样品前处理方法主要有分散固相萃取法[14]、固相萃取法[15]、多功能净化柱法[16]等。固相萃取法是较为常用的方法，但传统的吸附材料无法对PAT进行特异性捕捉，限制其应用。吕伟超等[17]采用自制固相萃取柱联用超高效液相色谱检测PAT，色谱杂峰多。分子印迹聚合物(MIPs)技术与固相萃取(SPE)技术结合可望解决上述问题，这是基于MIPs有特定结构的孔穴，能特异性结合目标物分子，因而有很高的专一性与准确度。本研究以PAT类似物2-吲哚酮为替代模板，采用本体聚合法合成了具有特异性的PAT-MIPs，并以此为填料制备了固相萃取小柱，联用HPLC法分析了苹果汁复杂基质中的PAT含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

e2695型高效液相色谱，沃特世公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵，上海科升仪器有限公司。

展青霉素(PAT)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、2-吲哚酮(Oxin)、偶氮二异丁腈(AIBN)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；5-羟甲基糠醛(5-HMF，上海安谱科学仪器有限公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；无水NaAc、乙酸乙酯、冰HAc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为去离子水。

1.2 HPLC条件

色谱柱：SμnFireRM C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈∶HAc∶水=5∶0.5∶94.5(V/V/V)；等度洗脱；流速1 mL/min。柱温30 ℃；检测波长276 nm；进样体积10 μL。

1.3 PAT-MIPs的制备

准确称取0.6658 g替代模板Oxin溶解在25 mL的乙酸乙酯中，加入2.146 mL的功能单体4-VP。超声15 min，常温静置孵育6 h。加入0.25 g引发剂AIBN和3.95 mL交联剂EGDMA。超声脱气15 min，充入氮气15 min，60 ℃下水浴24 h。将所得的固体物质研磨，过分子筛。然后以乙酸乙酯为提取剂索氏提取12 h，再以甲醇∶乙酸(9/1,V/V)混合液为提取剂索氏提取24 h，最后以甲醇作为提取剂在索氏提取器上洗脱12 h。最终将经过索氏提取的固体物质放入干燥箱中烘干24 h。非印迹聚合物(NIPs)的制备在合成步骤上与MIPs相同，但不加模板分子。

1.4 PAT-MIPs的静态吸附试验

分别称取5、10、20、30、40 mg的MIPs和NIPs于离心管中，加入1.5 mL的PAT标准溶液(20 mg/L)。将离心管置于摇床上振荡60 min，然后2 000 r/min高速离心3 min，过0.22 μm滤膜，利用HPLC法检测上清液中PAT的浓度，计算聚合物静态吸附百分比。

1.5 PAT-MIPs的吸附动力学及印迹因子试验

分别称取10 mg的MIPs和NIPs于离心管中，再加入1.5 mL的PAT标准溶液(20 mg/L)。将离心管置于摇床上振荡(时间范围为0～60 min,梯度为15 min)，然后以2 000 r/min高速离心3 min，过 0.22 μm 滤膜，利用HPLC法检测上清液中PAT的浓度，计算出各个样品的吸附容量。根据饱和吸附容量计算聚合物的印迹因子(Imprinting Factor，IF)[18]。

1.6 分子印迹固相萃取小柱的制备

在5 mL聚丙烯固相萃取空柱中均匀填入200.0 mg制备的MIPs，分别在聚合物上下两侧加盖聚乙烯筛板，填充均匀，用玻璃棒轻轻压实，得到柱压适当的分子印迹固相萃取(MISPE)小柱。

1.7 样品前处理及MISPE过程

在10 mL离心管中精确移取1.5 mL苹果汁样品，加入100 μL的PAT标准储备液(200 mg/L)，再加入乙酸乙酯5 mL，混匀。超声5 min，使苹果汁中的PAT被完全萃取。静置5 min，移取上清液于洁净离心管中。在40 ℃条件下用氮气吹干离心管中的乙酸乙酯，再加入5 mL乙酸盐缓冲液复溶，以待后续净化。

向MISPE小柱中按序加入3 mL甲醇和3 mL水进行活化处理，再加入5 mL复溶的溶液上样，最后加入3 mL去离子水淋洗。排净小柱中的液体后，加入3 mL乙酸乙酯作为洗脱液洗脱柱中吸附的PAT。收集洗脱液，40 ℃氮气吹干。加入1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜，利用HPLC法检测。

2 结果与讨论

2.1 制备条件的优化

2.1.1 模板分子的优化控制其他条件不变，以PAT结构类似物2-羟基烟酸(2-HNA)和Oxin为替代模板分子制备聚合物并比较其吸附性能。结果如图1所示，以Oxin为模板分子制备的MIPs吸附效果优于2-HNA，因此选择Oxin为替代模板。

2.1.2 反应溶剂的优化MIPs制备过程中，反应溶剂的选择不仅影响了聚合反应的发生，也影响着MIPs的性能。控制其他条件不变，分别选用甲醇、乙酸乙酯和乙腈三种溶剂作为反应溶剂制备MIPs，比较聚合物的吸附性能。不同溶剂制备的MIPs吸附性能排序依次为：乙酸乙酯>甲醇>乙腈。乙酸乙酯作为反应溶剂时制备的MIPs对PAT吸附容量可达630 μg/g，显著高于其他溶剂(P<0.05)，且乙酸乙酯安全性最好，因此选择乙酸乙酯作为反应溶剂进行后续实验。

2.1.3 功能单体的优化分别以APTES、4-VP、MAA及AM作为功能单体制备PAT-MIPs，将制得的聚合物作为吸附剂，用PAT标准溶液进行平衡吸附实验得到各个样品的吸附容量，以APTES和4-VP为功能单体制作的聚合物吸附性更好，两者差异不大(P>0.05)。再用PAT和5-HMF的混合标准溶液分别测定各个样品中PAT与5-HMF相对分配系数,结果如图2所示。4-VP制作的聚合物选择性更好，选择性对预处理样品中PAT的富集和高效检测有重要的影响，因此最终选择4-VP作为功能单体。

图1 模板分子的优化Fig.1 Optimization of template molecules

图2 功能单体选择性的比较Fig.2 Comparison of the selectivity of functional monomers

2.2 聚合物扫描电子显微镜(SEM)表征

图3为PAT-MIPs(a)及NIPs(b)的扫描电镜(SEM)图。可以看出PAT-MIPs表面较为粗糙，形成了特定的疏松孔穴结构，说明模板分子已洗脱，存在的孔穴能够与目标分子相匹配，而NIPs仍较为光滑，结构紧实，没有能与目标分子结合的位点。

图3 PAT-MIPs(a)和PAT-NIPs(b)的扫描电镜(SEM)图(放大倍数为×20.0 K)Fig.3 SEM images of PAT-MIPs(a) and PAT-NIPs(b)(Magnification of ×20.0 K)

2.3 色谱条件的选择

5-HMF通常被认为是PAT检测中的主要干扰物。按照1.2 HPLC条件测定PAT和5-HMF的混合标准工作液(10 mg/L)，考察其分离情况。结果如图4所示，PAT及5-HMF分离度良好，它们的保留时间分别为3.25 min和3.57 min。

2.4 聚合物静态吸附分析

由图5可知，随着加入的MIPs和NIPs的质量增加，MIPs和NIPs对于溶液中PAT的吸附百分比逐渐增大；但MIPs的吸附百分比始终大于NIPs，当投入的聚合物质量达到40 mg时，MIPs的吸附百分比(58.70%)近似于NIPs吸附百分比(18.85%)的三倍，这证明了MIPs中具有与目标物PAT相匹配的孔穴结构，使MIPs能够表现出优于NIPs的吸附性能。

2.5 吸附动力学及印迹因子

聚合物的吸附动力学结果如图6所示，振荡前45 min，MIPs对于PAT的吸附容量随着时间的增加而增大，且MIPs相比NIPs有更高的吸附速率。振荡45 min时MIPs吸附容量为898.0 μg/g达到最高点，之后趋平，因此45 min为饱和吸附时间，并以此为条件进行IF的计算。

由表1可知，饱和吸附条件下MIPs吸附目标物质PAT的性能达到NIPs的3.114倍，表明MIPs对于PAT具有特异性吸附的能力。

图6 MIPs和NIPs的吸附动力学曲线Fig.6 Adsorption kinetics curve of MIPs and NIPs

表1 MIPs与NIPs的吸附性能比较Table 1 Comparison of the adsorption properties of MIPs and NIPs

2.6 实际样品中PAT残留的测定

2.6.1 标准曲线与检出限配制PAT浓度分别为0、1、5、10、20、50 mg/L的标准溶液，结合MISPE-HPLC测得PAT液相色谱图,线性方程为:y=53 616x-17 562(y为PAT峰面积，x为PAT浓度(mg/L)，相关系数R2=0.9992)。在0～50 mg/L范围内，PAT的峰面积与浓度呈良好的线性关系。测定低浓度PAT标准溶液并计算信噪比(S/N)，以信噪比为3确定的方法检测限为3 μg/L。方法的精密度(RSD)为1.92%。

图7 未处理的苹果汁加标样品(a)、苹果汁加标样品乙酸乙酯提取(b)、苹果汁加标样品经乙酸乙酯提取及MISPE小柱净化(c)、苹果汁未加标经乙酸乙酯提取及MISPE小柱净化后(d)色谱图Fig.7 Chromatograms of untreated spiked apple juice sample(a),spiked apple juice sample after ethyl acetate extraction(b),spiked apple juice sample after ethyl acetate extraction and MISPE column cartridge purification(c),and unspiked apple juice sample after ethyl acetate extraction and MISPE column cartridge purification(d)

2.6.2 苹果汁中PAT残留的检测对苹果汁样品进行HPLC法检测，样品分别为：未处理的苹果汁加标样品(图7a)、苹果汁加标经乙酸乙酯提取样品(图7b)、苹果汁加标经乙酸乙酯提取及MISPE小柱净化后样品(图7c)和苹果汁未加标经乙酸乙酯提取及MISPE小柱净化后样品(图7d)。未处理的苹果汁加标样品存在十余种杂质峰，且基线不平，化学结构与PAT极其相似的5-HMF杂峰峰面积高。经乙酸乙酯提取后杂质峰减少，但5-HMF仍有较高峰面积，为提取前93.2%。再经MISPE小柱净化后基线平整，5-HMF峰明显降低，浓度仅为未经处理前13.70%，PAT回收率为89.3%，未加标的空白对照样品基线平稳，未检出PAT。结果表明样品经过MISPE小柱净化处理后，样品基质中杂质的残留量得到了有效控制，该方法有效净化了样品基质中的非目标物杂质，有效实现PAT选择性分离。

2.6.3 加标回收率取苹果汁样品，分别添加50、100、200 μL的PAT标准储备液(200 mg/L)，按照1.7方法处理，HPLC法测定，每个水平重复4次，结果见表2。PAT回收率在78.2%～90.1%之间，相对标准偏差(RSD)在5%以内，表明PAT-MIPs萃取结合HPLC法能够有效地检测苹果汁中的PAT含量。

表2 苹果汁中PAT的加标回收率(n=4)Table 2 Recoveries of PAT spiked in apple juice samples(n=4)

3 结论

本实验成功制备了具有特异吸附性的PAT分子印迹聚合物，并以此为填料制备了固相萃取柱，结合HPLC法检测了苹果汁中PAT的含量。实验结果证明，该方法能有效降低苹果汁复杂食品基质中的5-羟甲基糠醛等干扰物干扰，可以消除十余种杂质峰，回收率达到78.2%～90.1%，选择性好，具有较高的应用价值，可为PAT引起的食品安全检测提供有力的支撑。