高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法测定茶叶中的氟虫腈及其代谢产物

徐潇颖， 梁晶晶， 赵超群， 陈万勤， 刘 柱

(浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052)

氟虫腈(Fipronil)是法国罗纳-普朗克公司开发生产的一种高活性的苯基咪唑类广谱性杀虫剂[1]，2017年8月初，荷兰爆出的波及全球食品安全问题的“毒鸡蛋”事件使它成了世人瞩目的焦点。但早在1993年氟虫腈作为农药就被引入中国市场，主要通过干扰氯离子的通路，破坏昆虫的中枢神经系统杀灭鳞翅目和直翅目的害虫，以及在土壤中的鞘翅目害虫的幼虫，同时对于环戊二烯类、菊酯类、氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的害虫也有极高的敏感性[2,3]。现有动物实验研究表明，短期摄取大量氟虫腈会对神经系统造成不良影响，长期摄取则会损伤肝脏、甲状腺和肾脏。除此之外，施用氟虫腈后，通过环境中的氧化还原及光解作用，会生成氟甲腈(MB46513)、氟虫腈砜(MB46136)、氟虫腈硫醚(MB45950)等代谢物[4]，研究已证实氟甲腈砜对淡水生物的毒性比氟虫腈高6倍以上[5,6]。联合国粮农组织和世界卫生组织农药残留联席会议(JMPR)建立的氟虫腈成人摄入量(ADI)为每天不超过0.0002 mg/kg体重[7]。欧盟规定茶叶中氟虫腈的最大残留限量(MRL)为0.005 mg/kg，日本对该限定值的设定在0.002 mg/kg。我国国家标准(GB 2763-2016)《食品中农药最大残留限量》中也对氟虫腈在24项植物源性食品中的残留限量进行了规定，但对于茶叶中的残留限量未作规定。

我国茶叶资源丰富，但来自各茶叶进口国的非关税壁垒使中国茶叶出口遇到前所未有的压力，其中最严重的问题之一就包括农药残留超标[8]。目前已有关于茶叶中氟虫腈及其代谢物的残留分析方法，主要包括气相色谱法(GC)[9,10]、GC-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱法(LC)[11,12]以及LC-MS/MS[13,14]。其中，沈伟健等[15]及陈沙等[16]采用GC-MS/MS法实现了水果及水产品等不同基质中氟虫腈的分析测定；宁霄等[17]通过LC-MS/MS法对动物源性样品中的氟虫腈及其代谢物进行分析。高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法具有多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)检测模式，能够对未知化合物进行双重定性，可排除假阳性结果，提高定性分析的准确度；同时高选择性和高灵敏度的扫描获得化合物的峰面积信息，进而对化合物进行定量分析。传统的固相微萃取、加速溶剂萃取和凝胶电泳等前处理方法操作步骤繁琐，且耗费较大。近年来，在农药残留检测过程中QuEChERS方法作为前处理净化手段广泛被应用，该方法具有精准度高、操作简单、成本低廉等优势。针对茶叶样品基质复杂，为达到更好的净化效果，降低在后期分析过程中的基质效应[18,19]，本文通过改进QuEChERS方法，并结合线性离子阱灵敏度高、定量定性准确性好的优点，建立快速、简便、净化效果好的监测方法，不仅能够有效应对突发性、大批量茶叶样品中氟虫腈及其代谢物的检测需求，且检测过程绿色环保[20,21]。该方法较传统方法简化了前处理操作，提高了检测效率，并且降低了检出限。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

AB Qtrap5500质谱仪(美国，AB Sciex公司)；XR 30AD液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore公司)；涡旋混合器(上海琪特公司)；Multi-Prep快速匀浆仪(美国，Pro Scientific公司)。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜和氟虫腈砜标准品(纯度≥98%,Dr.Ehrenstorfer)；甲醇(质谱纯,德国Merck公司)；乙腈(质谱纯,德国Merck公司)；NH4Ac(分析纯,国药试剂公司)；多壁碳纳米管(MWCNTs)(纯度>97%,直径20～40 nm,长度>5 μm)深圳市纳米港科技有限公司；石墨化炭黑(GCB)、乙二胺-N-丙基(PSA)、十八烷基硅烷(C18)均购自于天津Agela公司。

1.2 样品前处理

将市场购买的茶叶样品放入食品粉碎机中制成粉末，称取5.00 g样品于50 mL离心管，加入20 mL乙腈，10 000 r/min下均质1 min，超声提取10 min后，于5 000 r/min离心5 min，转移上清液后，重复提取1 次，合并两次上清液后待净化。精确移取上述提取液4 mL于10 mL离心管中，加入0.5 g GCB及0.1 g MWCNTs后，涡旋2 min后，5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，作为待测定液。

1.3 色谱-质谱条件

Agilent Poroshell色谱柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)。流动相A：5 mmol/LNH4Ac；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0～3.0 min，65%～72%B；3.0～4.0 min，72%～98%B；4.0～5.0 min，98%B；5.0～7.0 min，98%～65%B；7.0～10.0 min，65%B。流速：0.35 mL。进样量：1 μL。柱温：35 ℃。

离子源为电喷雾电离(ESI)源；扫描方式：负离子扫描模式；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：-4 500 V；离子源温度(TEM)：500 ℃；雾化气压力(GS1)：50 psi；辅助气电压(GS2)：50 psi；气帘气压力(CUR)：40 psi。定性离子对、定量离子对、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)见表1。

表1 氟虫腈及其代谢物的质谱参数条件Table 1 ESI-MS/MS parameters for fipronil and its metabolites

IDA(信息关联采集)条件：在上述质谱条件下增加IDA监测模式，监测响应值超过1 000的最强的一个离子，建立EPI扫描模式，扫描分子量200～500 Da的离子，扫描速率10 000 Da/s。EPI电压参数：DP：-50 V；CE：-30 V；CES(Collision Energy Spared)：25 V。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

氟虫腈及其代谢物结构相似且为弱极性，因此选择C18色谱柱进行分离，通过比较Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)以及Zorbax Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)，发现4种化合物在上述三种不同规格色谱柱上峰形对称、峰宽窄。由于本文在质谱分析时，需通过EPI模式获得增强子离子流图，而该模式下良好谱图获得需要不同的目标化合物在分析柱上相互分离。通过对不同梯度洗脱程序的比较，Agilent Poroshell 120 EC-C18柱可实现氟虫腈及其代谢物的良好分离效果，因此选择该色谱柱作为分析柱。

氟虫腈及其代谢物在结构式上都有氨基，既可以通过得到一个质子形成[M+H]+，也可以失去一个质子形成[M-H]-，但是在负离子模式下干扰更小，基线响应更低，因此本文采用负离子模式。为在该扫描模式下获得的目标物响应更高，分别对水-甲醇、水-乙腈、5 mmol/L NH4Ac溶液-甲醇以及0.1%甲酸水溶液-甲醇4种流动相体系进行考察。结果显示，以5 mmol/L NH4Ac溶液-甲醇作为流动相时目标物的响应值最大，且稳定性良好，所以，选择其作为流动相条件。

2.2 MRM-IDA-EPI扫描模式的建立

图1 氟虫腈及其代谢物的MRM和EPI图谱(200 ng/mL)Fig.1 MRM and EPI of fipronil and its metabolites(200 ng/mL) a.MRM chromatogram of Fipronil;b.MRM chromatogram of Fopronil-Desulfinyl;c.MRM chromatogram of Fopronil-Sulfone;d.MRM chromatogram of Fopronil-Sulfine;e.EPI spetrum of Fipronil;f.EPI spetrum of Fopronil-Desulfinyl;g.EPI spetrum of Fopronil-Sulfone;h.EPI spetrum of Fopronil-Sulfine.

分别取氟虫腈及其代谢物混合工作溶液(浓度200 ng/mL)，通过对特征子离子的选择、CE和DP的优化最终得到MRM参数。然后利用MRM-IDA-EPI模式，按照常规定量方法设定目标物的MRM离子对，当MRM通道采集信号的强度超过预设值后，就会触发EPI增强子离子扫描模式，进而得到相应化合物的增强二级离子全扫描质谱图；同时建立标准物质EPI质谱库辅助定性。而MRM采集的数据可同时作为定量分析的数据。相比于MRM模式，EPI谱图由离子阱采集，增强了二级碎片子离子扫描，提高了灵敏度，且为全扫描质谱图，确证信息更为丰富，可以有效辅助痕量水平或检出限浓度样品的定性确证，弥补了传统四极杆MRM模式对低浓度样品的定性难题。图1中显示了10 ng/mL相同浓度目标化合物在MRM-IDA-EPI模式与传统MRM模式下得到的离子流图，可以发现，氟虫腈通过EPI模式扫描获得的离子流图响应值是其MRM离子流图响应值的3倍，氟虫腈砜EPI获得的离子流图的响应值是其MRM离子流图响应值的2倍。将获得子离子的全扫描谱图，与对照品建立的的特征谱库进行比对，完成进一步的确证。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择在植物源性食品的农药残留分析中常用的提取溶剂有水、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。采用纯水提取时，茶叶中色素、糖、氨基酸、多酚类等大量水溶性杂质被提取出，基质干扰严重，导致目标物离子化效率低，方法定量限难以达到。所以本文采用有机溶剂进行直接提取，在不同的有机溶剂中，以乙腈的提取效果最好，提取出的杂质少，有利于后续的净化。

2.3.2 QuEChERS方法的优化在传统的QuEChERS方法中，采用的净化吸附剂是GCB、PSA以及C18吸附剂。其中GCB作为弱极性或非极性吸附剂，能够有效去除色素和甾醇等疏水性化合物；PSA通过阴离子交换吸附蛋白质、糖类和极性较高的酸性物质；C18吸附脂肪和脂类等非极性干扰物。而MWCNTs可通过π-π共轭等相互作用力和较强的表面吸附作用去除基质，也具有净化效果。本实验分别考察上述净化粉末，其中GCB、PSA、C18三种吸附剂添加量分别为50、100、500 mg，MWCNTs的添加量在10、20、100 mg，分别对4 mL样品提取溶液进行净化后，在200～700 nm范围内进行紫外扫描。结果显示，随吸附剂添加量的增加，对紫外吸收在380～420 nm及640～680 nm的基质净化效果显著提高，其中640～680 nm处的吸光物质主要为叶绿素，380～420 nm处则为叶黄素，GCB和MWCNTs对色素的净化效果较C18、PSA更好。在波长280 nm处出现的吸光峰主要是由于茶叶中的天然多酚类物质，当GCB的添加量达到500 mg时，天然多酚类物质类物质被明显吸附。

对于不同净化剂的净化效果，通过三维荧光光谱图进行辅助分析。茶叶基质中存在大量具有荧光特性的成分，此时采用三维扫描，可以得到在每个激发波长以及发射波长下的荧光值，通过特征峰的比较，考察净化后样品的三维荧光光谱图(图略)。激发波长大于等于发射波长部分为非荧光，结果显示PSA和C18净化后的提取液在三维荧光扫描下的谱图与未净化提取液的图谱相似，发射波长在660～680 nm处有多个明显峰，说明两者对茶叶提取液中具有荧光特性的基质吸附效果不明显。经过GCB净化后，发射波长在660～680 nm的峰强度及数量下降明显，但激发波长260～280 nm，发射波长300～350 nm处仍存在明显吸收峰。而经MWCNTs吸附后，发射波长在660～680nm处的峰，相比于样品溶液强度下降，激发波长260～280 nm，发射波长300～350 nm处的吸收峰强度较GCB净化后的有所下降。因此GCB和MWCNTs同时使用可以达到较好的净化效果。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限和定量限用基质溶液配制氟虫腈及其代谢物1.0～20.0 μg/L系列标准溶液，绘制标准曲线，以目标物的峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg/L)为横坐标进行线性拟合，并以添加样品色谱峰响应值为3倍噪音的浓度为方法检出限(LOD)，以10倍噪音的浓度为方法定量限(LOQ)，结果见表2。氟虫腈及其代谢物在1.0～20.0 μg/L浓度范围内呈良好线性关系，相关系数均在0.999以上，检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg，可满足欧盟及日本对茶叶中氟虫腈残留的限量要求。

表2 氟虫腈及其代谢物的回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Ranges,regression equations,correlation coefficients(R2) and LODs and LOQs of fipronil and its metabolites

2.4.2 准确度与精密度考察在阴性红茶样本中加入混合标准溶液，使加标水平为1、3和10倍信定量限，每个水平平行测定6次，采用基质标准曲线进行定量分析，计算回收率及相对标准偏差(RSD)对方法的准确性和可靠性进行验证，结果列于表3。结果显示，氟虫腈及其代谢物的平均加标回收率在82.7%～98.1%之间，相对标准偏差(RSD)在1.3%～4.6%之间，证明本方法的准确度和精密度良好，满足茶叶中氟虫腈及其代谢物的测定要求。

表3 氟虫腈及其代谢物在红茶中的加标回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in spiked black tea samples(n=6)

2.5 实际样品的测定

利用本实验建立的线性离子阱串联质谱法随机对市售的本省生产的20批茶叶(红茶、绿茶、乌龙茶和茉莉花茶各5批)进行了检测。检测结果显示，绿茶、乌龙茶和茉莉花茶各有一批检出，具体检出情况见表4。在检出氟虫腈及其代谢物的三批茶叶中氟甲腈砜的检出量都高于0.03 mg/kg，而目前的检测标准(GB 23200.34-2016)中仅规定了氟虫腈的定量限为0.002 mg/kg，且对茶叶中氟虫腈及其代谢物的最大残留量并未规定，而氟虫腈代谢物的毒性远高于氟虫腈，因此从安全角度考虑，分析氟虫腈及其代谢物残留更有意义[5]。根据本文方法氟虫腈及其代谢物的定量限1.0 μg/kg，绿茶样品中除氟虫腈亚砜外，其余化合物都有检出，茉莉花茶样品中只有氟虫腈砜有检出，乌龙茶中的氟虫腈及其代谢物都有检出，对有检出的物质，将样品采用MRM-IDA-EPI扫描模式获得的EPI谱图与采用标准物质建立的EPI谱库进行比对后得到确证结果。采用国家标准方法(GB 23200.115-2018)《鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》对阳性样品进行确证，两种方法得到的结果偏差在10%以内，说明本方法的结果具有可靠性。

表4 检出氟虫腈及其代谢物的茶叶样品的检测结果Table 4 Determination results for tea samples containing fipronil and its metabolites

3 结论

本研究采用QuEChERS方法，结合高效液相色谱-线性离子阱-串联质谱法测定茶叶中氟虫腈及其代谢物残留量的检测方法。本方法样品前处理简单快速、回收率高，精密度和准确度均能满足痕量分析的要求，方法灵敏度优于现行国家标准，且通过建立EPI谱库可对疑似阳性样品进行确证。为其在茶叶种植过程中的违规使用的监管监测提供理论依据和技术支撑。