液相色谱-串联质谱法检测畜禽产品中的羟甲烯龙

王 晗， 赵晓亚， 叶 诚， 尚吟竹， 周 艳， 车志彦， 陈新艳， 郑茜玥， 谭 杰， 吴建安， 王 鹏*

(武汉海关，湖北武汉 430050)

图1 羟甲烯龙的化学式Fig.1 The chemical formula of oxymetholone

羟甲烯龙是一种合成代谢类雄激素，羟甲烯龙的化学结构如图1所示。该药物能够作为口服类固醇被动物吸收[1,2]，可以用于贫血和HIV相关的肌肉萎缩症的治疗。羟甲烯龙其在动物体内不仅能促进蛋白质合成、抑制蛋白质异化，还能降低血胆固醇、减少钙磷排泄、促进发育、组织新生和肉芽形成。因此，它可能被非法用于动物的育种和养殖环节，并残留在动物源性食品中。对于运动员这一特殊人群，羟甲烯龙是“国际反兴奋剂组织”(WADA)明确禁用的蛋白同化制剂[3]，日常饮食中摄入含有羟甲烯龙的食品极有可能造成兴奋剂阳性检出[4 - 6]。对于普通消费者，羟甲烯龙的摄入则会造成肝脏及心血管损伤、引发睾丸癌及精神障碍等疾病[4,7]。基于此，必须建立针对畜禽产品中羟甲烯龙的有效检测方法。

羟甲烯龙的检测手段包括气相色谱-质谱法[8]和液相色谱-串联/质谱法。其中液相色谱-串联质谱法相较于气相色谱-质谱法的灵敏度更高、选择性也较好，因此被广泛应用于合成代谢类雄激素的检测之中[9 - 13]。但由于畜禽产品基质差异较大，而羟甲烯龙在食品中的残留量较低，因此目前文献中的检测方法往往仅适合于单一基质，而建立通用于多种畜禽产品的检测方法具有一定的难度。本工作拟采用基于液相萃取的前处理手段，与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用，建立适合于多种畜禽产品基质中羟甲烯龙检测的分析方法，用于畜禽产品中羟甲烯龙的食品安全监督检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QTRAP 6500型液相色谱-串联质谱联用仪(AB SCIEX,USA)；2-16PK型低温离心机(Sigma,Germany)；MS2型漩涡混合仪(IKA,Germany)；TurboVap LV型氮吹仪(Biotage,Sweden)；MS型分析天平(Mettler Toledo Instruments Co.,Ltd.,China)。

羟甲烯龙标准品(纯度≥98%)溶液：称取羟甲烯龙标准品，用甲醇溶解，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，-18 ℃下避光保存，在实验过程中精确吸取适量标准溶液，用0.1%甲酸-甲醇溶液逐级稀释至所需浓度。β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(β-葡萄糖醛酸酶活力>100 000 U/mL，芳基硫酸酯酶活力<20 000 U/mL)购自天津阿尔塔科技有限公司。甲醇、甲酸、乙醚、HAc均为色谱纯试剂(LiChrosolv,Merck,Germany)，其他试剂为分析纯。NaAc-HAc缓冲液：称取13.6 g NaAc，溶解于500 mL水中，用适量HAc调节pH至5.2，该缓冲溶液用于动物源性样品的酶解。

1.2 样品制备

猪肉、牛肉、羊肉(约500 g)放入组织捣碎机均质，充分混匀，备用。新鲜鸡蛋取16枚(约1 kg)，洗净去壳后充分混匀，备用。牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。

称取5.0000 g试样置于50 mL离心管中，加入10 mL NaAc溶液，25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于温度37 ℃条件下水浴振荡2 h。向离心管中加入约1.5 mL饱和Na2CO3溶液使混合溶液的pH为10，加入20 mL乙醚，5 g NaCl和2 g无水MgSO4，剧烈摇晃后涡旋混匀1 min，振荡提取30 min，以4 000 r/min转速在-4 ℃下离心10 min，取出后继续放入-20 ℃冰箱中冷冻至水相凝固，取上层乙醚于50 mL离心管中，氮吹至近干，准确加入1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)溶解残渣，过0.22 μm滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.3 色谱及质谱检测条件

色谱柱：XSELECT HSS T3柱(100 mm×3.0 mm，3.5 μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序如下：0.00～1.00 min，保持流动相A为70%；1.00～2.00 min，流动相A由70%变为30%；2.00～3.00 min，保持流动相A为30%；3.00～4.00 min，流动相A由30%变为5%；4.00～8.00 min，保持流动相A为5%，流动相B为95%；8.00～8.10 min，流动相A由5%变为70%；8.10～10.00 min，保持流动相A为70%。柱温：30 ℃，流速：0.4 mL/min，进样量：5 μL。

离子源为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子扫描，以多反应监测(MRM)模式检测，雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体。电喷雾电压5 500 V，离子源温度500 ℃，气帘气压力241 kPa，雾化气压力413 kPa，辅助气压力344 kPa。羟甲烯龙的定量离子对为m/z333.0/99.0，监测离子对为m/z333.0/159.2，去簇电压140 V，碰撞能量分别为40 eV和30 eV。

2 结果与讨论

2.1 质谱检测条件优化

羟甲烯龙质谱检测条件在Manual Tuning模式下进行优化。将1.0 mg/L羟甲烯龙溶液以7 μL/min的速度泵入质谱仪中，在Q1 MS模式下寻找母离子，发现其为m/z333.0；之后对去簇电压进行优化，选择为140 V；在Product Ion模式下寻找子离子，发现其子离子包括m/z99.0和159.2，其中m/z99.0强度更高，确定其为定量子离子；在MRM模式下对碰撞能量进行优化，确定离子对为m/z333.0/99.0和333.0/159.2的碰撞能量分别为40 eV和30 eV。

2.2 液相分离条件优化

采用MRM模式的LC-MS/MS法进行分析时，必须尽可能的防止流动相中共流出物对待测组分的离子抑制作用。本工作比较了XSELECT HSS T3色谱柱、CAPCELL PAK C18 MG色谱柱、ZORBAX SB-C18色谱柱对羟甲烯龙的保留情况。结果表明，在Waters XSELECT HSS T3色谱柱上羟甲烯龙的保留时间适中、峰形更加尖锐对称，且与样品基质峰能彻底分离。因此，在后续检测中采用该色谱柱进行分离检测。

羟甲烯龙的色谱检测条件的优化，采用混合畜禽产品基质提取液加标至100 ng/mL作为模拟样品，以监测离子对m/z333.0/99.0和333.0/159.2的色谱分离情况为标准，考察不同流动相条件下羟甲烯龙与基质峰分离情况，确定了1.3中的色谱分离条件。

2.3 样品提取条件的选择

羟甲烯龙在动物体内会发生葡萄糖醛酸结合和硫酸盐结合反应[1]，因此畜禽产品中羟甲烯龙的测定需要先进行酶解。本工作使用商品化的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶试剂进行酶解[1]。称取5.0000 g样品，加入10 mL NaAc-HAc缓冲溶液，涡旋混匀后，加入25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，再涡旋混和，于37 ℃水浴2 h。

在提取条件的优化中，采用混合基质样品进行条件考察，将猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋和牛奶样品进行等分(m/m)混合。

2.3.1 pH的选择羟甲烯龙的logP值为4.4，pKa为4.5，是具有一定极性的酸性物质，因此考虑采用合适的有机溶剂在碱性条件下对其进行萃取。本工作以Na2CO3-NaHCO3缓冲体系为基础，考察了pH在7～12范围内，羟甲烯龙在不同pH条件下的提取效果，结果如图2中所示。结果表明，羟甲烯龙的提取效率随着pH的升高而上升，pH=9时基本达到平台，因此选择pH=10作为提取的pH。

2.3.2 提取溶剂及体积的选择实验比较了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作为提取剂对羟甲烯龙提取效率的影响。结果如图3中所示，乙醚的提取效率最佳，且在离心分离过程中，水相及有机相分层最为清晰，而二氯甲烷尽管提取效率近似于乙醚，但由于其密度大于水，因此在离心后位于离心管下层，不利于有机相与样品的分离。因此，实验采用乙醚为提取溶剂。

考察了5、10、15、20、25和30 mL乙醚用量下羟甲烯龙的提取效果，结果表明，随着提取剂使用量的增加，羟甲烯龙的提取效率有所增加，但到15 mL后就不再上升，因此，后续实验中采用20 mL乙醚作为提取溶剂。

图2 不同pH条件对羟甲烯龙的提取影响Fig.2 Effect of pH on the extraction of oxymetholone

图3 不同提取溶剂对羟甲烯龙的提取影响Fig.3 Effect of extraction solvent on the extraction of oxymetholone

2.3.3 净化方式考察考虑到畜禽产品基质复杂，本工作尝试采用QuEChERS法中常用的吸附剂乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)及石墨化炭黑(GCB)对提取液进行净化，结果表明三种吸附剂均对有机提取液中的羟甲烯龙有一定的吸附作用。

随后考察了固相萃取(SPE)净化的可行性，对HLB(3 cc/60 mg)和C18(3 mL/100 mg)两种SPE小柱进行考察。采用HLB和C18小柱对3 mL乙醚提取液进行净化，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脱的情况下，HLB对提取液中羟甲烯龙的吸附率为16.2%，C18对提取液中羟甲烯龙的吸附率为17.1%，HLB洗脱后的最终的萃取效率为10.5%，C18洗脱后的最终的萃取效率为10.9%；溶剂置换后采用极性更大的甲醇重溶上样予以考察，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脱，该条件下HLB对提取液中羟甲烯龙的吸附率为37.7%，C18对提取液中羟甲烯龙的吸附率为42.5%，HLB洗脱后的最终的萃取效率为31.8%，C18洗脱后最终的萃取效率为34.9%，因此采用SPE虽然能在一定程度上对样品基质进行净化，但无法满足对提取液中羟甲烯龙定量萃取的要求。通过LC-MS/MS检测条件的优化，各基质加标样品的提取液直接氮吹重溶后，色谱图中不会出现明显的干扰峰。因此本工作最终采用液相萃取、氮吹重溶后直接LC-MS/MS检测的方法进行羟甲烯龙的分析。

2.4 分析性能考察

在最优的实验条件下，对方法的分析性能进行了考察，检出限(羟甲烯龙响应值为噪声3倍时的浓度)为0.02 mg/kg，定量限(10倍信噪比)为0.05 mg/kg，线性范围为0.05～1.0 mg/kg，方法精密度为10.1%(n=7)，线性关系如表1中所示。不同基质中羟甲烯龙加标检出限浓度的色谱图如图4中所示。

目前，羟甲烯龙在食品中尚无限量要求，而WADA对运动员尿样检测方法的检出限为5 ng/mL[3]，考虑到羟甲烯龙随食物在进入人体后的吸收及排泄有限，本方法可以满足畜禽产品中羟甲烯龙的日常检测安全监督。

表1 不同样品中羟甲烯龙的线性关系Table 1 The linear relationship of oxymetholone in different samples

图4 不同样品中羟甲烯龙检出限浓度的色谱图Fig.4 Chromatograms of oxymetholone(0.02 mg/kg) in different samples

2.5 实际样品分析

将本方法应用于市售的猪肉、牛肉、羊肉、牛奶及鸡蛋样品中羟甲烯龙的分析，在5种实际样品中均未检出羟甲烯龙。因此，采用加标回收实验验证本方法的准确性。由表2中结果可知，在不同样品中羟甲烯龙的回收率在80.2%～110.0%之间，表明本方法准确性良好，可用于多种动物源性基质中羟甲烯龙的分析检测。

表2 不同样品中羟甲烯龙的加标回收率(n=7)Table 2 Recoveries of oxymetholone in different samples(n=7)

ND:not detected.

3 结论

本工作建立了适用于多种畜禽产品基质中蛋白同化制剂羟甲烯龙的液相色谱-串联质谱检测方法。该方法的建立填补了目前国家及各行业标准中蛋白同化制剂羟甲烯龙的检测空白，有助于运动员食品中食源性兴奋剂检测工作的推进和满足食品安全监督检测需求。