光谱法研究甲苯达唑与牛血清白蛋白的相互作用

顾佳丽*， 王思宇， 杨 丹， 黄曦瑶， 何 茜， 秦洪伟

(渤海大学化学化工学院，辽宁锦州 121013)

苯并咪唑(BMZs)是一种合成的抗寄生虫药物，由于其高效性和广谱性，在农业和水产养殖中被广泛用于治疗吸虫和线虫感染[1]。但是不正确的使用会使BMZs在食用动植物产品中残留，并通过食物链在人体中累积，对人体健康构成潜在的危害[2]。动物实验证明，某些BMZs具有致畸和致突变的作用[3]，因此，BMZs被中国、美国和欧盟等多个国家和地区列为兽药残留的重要监控对象[4]，并制定了最大残留限量[5]。

BMZs对人体的毒性与血清白蛋白(SA)的储运功能密切相关[6]。SA作为人和动物血浆中重要的载体蛋白，可以与多种外源性物质结合，影响其在生物体中的储存、分布、代谢和毒性[7]。本文以BMZs中常用药物甲苯达唑(MBZ)为例，研究MBZ与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用机制，对于从分子水平上了解BMZs药物在生物体内的分布、吸收及潜在毒性具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

Fluoromax-4NIR型荧光分光光度计(法国，堀场)；FLS1000型稳态瞬态荧光光谱仪(英国，爱丁堡)；Jasco J-810型圆二色光谱仪(日本，分光)；UV2800型紫外-可见分光光度计(上海舜宇恒平)；傅里叶变换红外光谱仪(德国，布鲁克)。

牛血清白蛋白(BSA，Sigma)；甲苯达唑(MBZ)、华法林钠、布洛芬和8-苯胺-1-萘磺酸(阿拉丁)；乙腈(国药试剂)。BSA储备液(1.0×10-4mol·L-1)用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液配制，冷藏保存，现用现配；MBZ储备液(1.0×10-4mol·L-1)用乙腈溶解配制，避光保存；华法林钠与布洛芬储备液用乙醇配制。其它试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.2 时间分辨荧光光谱的测定室温下测定了BSA及其与MBZ作用的荧光寿命，激发波长290 nm，发射波长345 nm，量子点数收集5 000，采用仪器自带软件进行荧光寿命拟合。

1.2.3 紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)的测定于比色管中加1.0×10-6mol·L-1的BSA溶液3.0 mL，滴加MBZ溶液(1.0×10-4mol·L-1)，分别测定BSA及其与MBZ作用的紫外-可见吸收光谱。

1.2.4 圆二色光谱(CD)的测定波长范围200～250 nm，扫描速度100 nm·min-1，样品池光径1 mm，分辨率0.1 nm，分别测定BSA及其与MBZ作用的CD光谱。

1.2.5 傅里叶红外(FT-IR)光谱的测定采用衰减全反射法(ATR)记录了BSA及其与MBZ作用的FT-IR光谱，分辨率为4 cm-1，扫描分辨率为128。分别收集BSA溶液和缓冲溶液的光谱，并做差谱得到作用前的BSA的红外光谱，同样条件下扫描MBZ-BSA体系和MBZ的红外光谱，做差谱得到与MBZ作用后的BSA红外光谱。

1.2.6 8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)荧光光谱的测定固定ANS与BSA的浓度比为5∶1，滴加MBZ溶液，激发波长380 nm，发射波长400～600 nm，其它条件同荧光光谱法。

1.2.7 共振散射荧光光谱(RLS)的测定波长测定范围250～600 nm，Δλ=0 nm时同步扫描BSA及其与MBZ作用的RLS光谱。其它参数设定同荧光光谱测定。

1.2.8 位点竞争实验固定BSA与MBZ的浓度比为1∶5，变化华法林或布洛芬的浓度从5.0×10-7～2.5×10-6mol·L-1，测定荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 MBZ与BSA相互作用的荧光光谱

图1 BSA与MBZ作用的荧光光谱Fig.1 Fluorescence of spectra of BSA and MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

BSA与MBZ作用的荧光光谱见图1。BSA在波长347 nm处有较强吸收峰，随着MBZ浓度的增大，BSA的荧光强度降低且蓝移至344 nm。这表明MBZ会猝灭BSA的荧光强度，并影响氨基酸周围微环境，疏水性增加[9]。

2.2 荧光猝灭机制

荧光猝灭机制主要有动态猝灭和静态猝灭。猝灭过程符合Stern-Volmer方程[10]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q])。以F0/F对[Q]作图，由曲线斜率求出MBZ对BSA的猝灭常数KSV见表1。KSV随温度的升高而减小，且三个温度下Kq均大于猝灭剂对蛋白质的最大扩散碰撞猝灭速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)，因此推断MBZ对BSA的猝灭主要为静态猝灭。

表1 BSA与MBZ作用的猝灭常数、结合常数、结合位点数及热力学常数Table 1 Quenching constants,binding constants and thermodynamics parameters of BSA and MBZ

2.3 结合常数及结合位点数

MBZ与BSA形成复合物，可用双倒数方程：(log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q])[11]，以log[(F0-F)/F]对log[Q]作图，由曲线的截距和斜率计算MBZ与BSA作用的结合常数KA及结合位点数n(表1)。KA均约为104L·mol-1，说明MBZ和BSA形成了较为稳定的复合物，BSA可以携带转运MBZ。n约为1，表明MBZ与BSA之间存在一个结合位点。

2.4 热力学参数及作用力类型

2.5 能量转移与结合距离的计算

根据Förster非辐射能量转移理论[13]，当供体的荧光发射光谱和受体的吸收光谱之间有充分的重叠，且作用距离小于7 nm时，它们之间很可能发生非辐射能量转移。由MBZ的吸收光谱和BSA的发射光谱重叠求得积分J=2.8×10-15cm3·L·mol-1，临界距离R0=1.98 nm，能量转移效率E=18.4%，作用距离r=3.84 nm，说明MBZ和BSA之间发生非辐射能量转移的可能性极高。r>R0，说明MBZ对BSA荧光猝灭主要是由静态猝灭引起的。

2.6 时间分辨荧光光谱

对于动态猝灭，猝灭剂会缩短荧光分子激发态寿命，而对于静态猝灭，荧光分子激发态寿命则不会发生改变。将BSA与MBZ作用前后的荧光衰减曲线进行双指数拟合，并根据方程：〈τ〉=(B1τ1+B2τ2)/(B1+B2)[14]计算BSA的荧光寿命为τ1=4.75 ns(38.65%)，τ2=6.75 ns(61.35%)，平均寿命5.98 ns(χ2=1.16)。与MBZ作用后，BSA的荧光寿命变为τ1=4.26 ns(52.95%)，τ2=7.12 ns(47.05%)，平均寿命5.61 ns(χ2=1.13)。MBZ没有引起BSA荧光寿命的明显改变，因此推断MBZ对BSA的猝灭主要为静态猝灭。

2.7 MBZ对BSA构象的影响

图2 BSA与MBZ相互作用的紫外-可见光谱Fig.2 UV-Vis absorbance spectra of BSA and MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,3,6,9,11.9,14.8,17.7(×10-6 mol·L-1).

2.7.1 紫外-可见吸收光谱图2为BSA与MBZ作用的吸收光谱，BSA分别在波长208 nm和278 nm处有两个吸收峰，208 nm处的较强吸收峰与BSA分子中肽链构象有关，278 nm处的较弱吸收峰与芳香氨基酸周围微环境的极性有关。随着MBZ浓度的增大，BSA在208 nm处的吸光度减小且红移至210 nm，278 nm处的吸收峰减小且略红移(1 nm)，这说明MBZ诱导BSA二级结构发生改变，且影响氨基酸残基周围微环境的极性减小[15]。

2.7.2 同步荧光光谱同步荧光光谱可以提供发色团周围微环境的特征信息。当Δλ=15 nm或Δλ=60 nm时，BSA的同步荧光光谱只显示酪氨酸或色氨酸的荧光光谱特征。由图3(A)可以看出，当Δλ=15 nm时，同步荧光光谱变化较小；而图3(B)表明，当Δλ=60 nm时，随着MBZ浓度的增加荧光强度减小且略有蓝移(349～347 nm)。说明MBZ主要猝灭的是色氨酸残基，并使其周围疏水性增加[16]。

图3 BSA与MBZ作用的同步荧光光谱Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of BSA with MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

图4 BSA与MBZ相互作用的CD光谱Fig.4 CD spectra of BSA and MBZ cBSA=1.5×10-6 mol·L-1,cMBZ/CBSA=0∶1,10∶1,20∶1.

2.7.4 傅里叶变换红外光谱红外光谱法是研究BSA二级结构变化的常用方法。BSA的红外光谱主要分为位于1 700～1 600 cm-1的酰胺Ⅰ带(C=O的伸缩振动吸收)，以及位于1 600～1 500 cm-1的酰胺Ⅱ 带(C-N伸缩振动与N-H面内弯曲振动)[18]。酰胺Ⅰ带对BSA的二次结构变化比酰胺Ⅱ带更敏感。利用傅里叶去卷积和二阶导数技术处理红外光谱，将酰胺Ⅰ带分解为多个子峰，并估算子峰的位置和宽度(图5)。通过曲线拟合，定量分析BSA二级结构各组分的含量为：反平行β-折叠(1 680～1 690 cm-1)11.0%；β-转角(1 680～1 660 cm-1)14.1%；α-螺旋(1 660～1 649 cm-1)53.2%；无规则卷曲(1 638～1 648 cm-1)13.5%；β-折叠(1 615～1 637 cm-1)8.2%。与MBZ作用后，BSA的反平行β-折叠含量增加到13.6%，β-转角含量增加到15.4%，α-螺旋含量减少到43.8%；无规则卷曲含量增加到17.7%，β-折叠增加到9.5%。这一结果说明MBZ使BSA二级结构发生改变，这一结果与圆二色光谱是一致的。

图5 BSA(A)与MBZ作用(B)的红外(IR)光谱Fig.5 IR spectra of BSA(A) and MBZ(B)

2.7.5 ANS荧光光谱ANS是一种对于疏水性环境敏感的荧光探针，常用于研究蛋白质表面疏水性变化。BSA-ANS体系与MBZ作用的荧光光谱如图6所示。ANS在水中的荧光强度很弱，但与BSA的疏水性基团结合后荧光强度显著增强。随着MBZ浓度的增大，BSA-ANS体系的荧光强度降低，这说明MBZ使BSA表面疏水性减少[19]。

2.8 共振散射光谱

BSA与不同浓度MBZ作用的共振散射光谱见图7所示。BSA的共振散射信号较弱，但随着MBZ浓度的增大，体系的共振散射强度显著增强，其原因可能是MBZ与BSA形成粒径较大的复合物，导致共振散射信号增强[20]。

图6 MBZ对BSA-ANS体系的荧光猝灭光谱Fig.6 Fluorescence quenching spectra of BSA-ANS by MBZ a:BSA,cBSA=1.0×10-6 mol·L-1.b:ANS,cANS=1.0×10-5 mol·L-1,cMBZ(c-i)=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

图7 MBZ与BSA作用的共振散射光谱Fig.7 RLS of MBZ and BSA cBSA=1.0×10-6 mol·L-1；cMBZ(a→e)=0,4.5,5.7,8.0,9.1(×10-6 mol·L-1).

2.9 结合位点

BSA通常有两个结合位点和药物发生结合，一是位于亚结构域ⅡA的色氨酸残基Trp212；二是位于亚结构域ⅢA的色氨酸残基Trp314，分别定义为Site Ⅰ和Site Ⅱ。华法林(Site Ⅰ)和布洛芬(Site Ⅱ)是最常用的位点探针。位点探针的百分数可用公式(Probe Displacement(%)=F2/F1×100%)计算[21]。结果表明，华法林使得MBZ-BSA体系的Probe Displacement(%)由92.0%下降至61.5%，布洛芬使得MBZ-BSA体系的Probe Displacement(%)由95.2%下降至94.0%。这说明MBZ和华法林在Site Ⅰ发生了竞争，即MBZ结合在BSA亚结构域ⅡA处的Site Ⅰ。

3 结论

本文通过多种光谱法研究了MBZ与BSA的相互作用机制。实验结果表明，MBZ会与BSA通过范德华力和氢键形成复合物，从而导致BSA荧光猝灭。UV-Vis光谱、同步荧光光谱、FTIR光谱和CD光谱实验结果表明，MBZ诱导BSA二级结构改变，并且影响色氨酸周围微环境。位点竞争实验表明，MBZ结合在BSA亚结构域ⅡA处的SiteⅠ。实验结果以期为从分子水平上了解苯并咪唑类药物与蛋白质的作用机制提供参考依据。