微波提取-电喷雾电离-离子迁移谱法快速筛查止咳平喘化痰类中成药中4种化学成分

郭亚格， 李珺沬*， 刘圆圆， 马振宇

(河北医科大学药学院，河北石家庄 050017)

近年来，随着工业化的快速发展以及经济水平的不断提高，环境污染问题日渐加剧，从而导致咳嗽、哮喘等呼吸系统疾病的发病率呈逐年上升趋势[1,2]。中成药具有作用缓和、毒副反应相对较小、疗程长等特点，因此非常适合于咳嗽、哮喘等慢性疾病的治疗[3,4]。然而，一些商家为了谋取暴利，向中成药中非法添加某些化学成分，以达到起效快、疗效显著的目的[5 - 7]。由于这些非法添加的化学药物种类和含量的不确定性，如果患者在不知情的情况下长期服用此类药物，可能由于摄入过量，发生毒副反应，严重危害身体健康以及生命安全[8,9]。因此，有必要对止咳平喘化痰类中成药中非法添加的化学成分进行监测。

目前，对于止咳平喘化痰类中成药中添加的化学成分的测定方法主要有薄层色谱法[10]、高效液相色谱法[11]、液相色谱-质谱联用法[12]等。离子迁移谱技术(Ion Mobility Spectrometry,IMS)[13 - 15]是基于不同的气相离子在电场中迁移速度的差异而对带电离子进行表征的一种分析技术，具有专属性强，灵敏度高，检测速度快，适用于现场快速筛查等特点，尤其是电喷雾电离(Electrospray Ionization,ESI)与IMS技术的结合，使IMS的应用范围逐渐扩大到药品[16]、食品[17]、环境监测[18，19]等领域。目前，已有文献报道将电喷雾电离-离子迁移谱(ESI-IMS)应用于中药中指标成分或非法添加物的分析[6,20]。然而，将该方法应用于止咳平喘化痰类中成药中非法添加化学成分的测定尚未见报道。本研究采用微波提取(MAE)技术对样品进行前处理，结合ESI-IMS技术建立了止咳平喘化痰类中成药中非法添加的4种化学成分盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新的快速筛查。该方法简便、快速、灵敏度高，适用于现场快速分析，同时也为监管部门监测药品及保健品中的非法添加物提供了一种强有力的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GA2100高效离子迁移谱仪，配有电喷雾离子源，VisIon Analysis分析软件(美国，Excellims公司)，进样方式为直接进样。高效液相色谱仪，配有L-6200A三元泵(日本，日立公司)，785A紫外检测器(美国，Applied Biosystems公司)。MDS-6G型多通量微波消解/萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)。

盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新对照品购自北京莱耀生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯，美国CNW公司)；超纯水(Milli-Q50系统制备)。

样品：复方罗汉果止咳颗粒；益肺止咳胶囊；固本咳喘片；百贝益肺胶囊；民间偏方1(胶囊，组方未知)；民间偏方2(片剂，组方未知)。

1.2 溶液配制

1.2.1 对照品溶液精密称取盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，用90%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成含上述对照品溶液浓度分别为1 mg/mL的对照品储备液。分别精密量取盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新对照品储备液0.5 mL、2 mL、0.5 mL和1 mL于10 mL容量瓶中，用90%甲醇稀释至刻度，摇匀，配成混合对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液取药品颗粒、胶囊(去壳)或片剂(去包衣)，于研钵中研细，精密称定各药品粉末约0.1 g，置于微波萃取罐中，加90%甲醇10 mL，于110 ℃下600 W微波提取5 min，冷却，过滤。精密吸取续滤液1 mL于10 mL量瓶中，用90%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.3 ESI-IMS工作条件

电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)，源电压：2.5 kV，迁移管电压：8.5 kV，迁移管温度：160 ℃，进气口温度：160 ℃，门电压：60 V，门宽度：100 μs。排出气流量：1.25 L/min，迁移气流量：1.25 L/min。

1.4 高效液相色谱(HPLC)工作条件

色谱柱：C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm；日本Shimadzu公司)。流动相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液(含0.2%三乙胺，用H3PO4调节pH=3.0)(5∶95,V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 ESI-IMS工作条件的优化

2.1.1 源电压的优化源电压对待测组分的响应强度具有重要影响。源电压过低，待测组分难以发生电离，源电压太高，由于溶剂分子等其它组分与待测组分发生竞争电离而导致待测组分的响应强度降低。本实验考察了源电压在2.0～3.0 kV范围内对待测组分响应强度的影响。结果表明，随着源电压的升高，各待测组分的响应强度逐渐增大，当源电压为2.5 kV时，响应强度达到最大值，结果如图1所示。本实验选择最佳源电压为2.5 kV。

2.1.2 迁移管电压的优化本实验在7.5～8.5 kV范围内对迁移管电压进行了优化。结果表明，响应强度随着迁移管电压的增加而增大，当迁移管电压为8.5 kV时，各待测组分的响应强度达到最大，结果如图2所示。本实验选择迁移管电压为8.5 kV进行后续分析测定。

图1 源电压对强度的影响Fig.1 The effect of source voltage on intensity

图2 迁移管电压对强度的影响Fig.2 The effect of drift tube voltage on intensity

2.1.3 迁移管温度的优化提高迁移管温度，可以有效减少迁移管内的记忆效应，从而提高检测灵敏度，而迁移管温度过高，会导致热交换加速、待测组分分解等一系列不稳定因素，从而使峰形展宽，响应信号降低。本实验考察了不同迁移管温度(150、160、170、180 ℃)对响应强度的影响。结果表明，当迁移管温度为160 ℃时，各待测组分的响应强度最大，如图3所示。本实验选择迁移管温度为160 ℃。

2.1.4 进气口温度的优化本实验考察了进气口温度在150～180 ℃对各待测组分响应强度的影响。结果表明，随着进气口温度的升高，各待测组分的响应强度逐渐增大，当温度为160 ℃时，响应强度最高，之后继续提高进气口温度，各待测组分的响应强度逐渐降低，如图4所示。本实验选择进气口温度为160 ℃。

图3 迁移管温度对强度的影响Fig.3 The effect of drift tube temperature on intensity

图4 进气口温度对强度的影响Fig.4 The effect of gas inlet temperature on intensity

2.2 进样溶剂的优化

在ESI-IMS中，待测组分在电喷雾离子源的作用下转化为带电离子，因此要求进样溶剂具有一定的导电性以提高待测组分的离子化效率。本实验分别选择甲醇和乙腈作为进样溶剂进行分析，结果表明，两种溶剂对待测组分响应强度的影响相差不大，但乙腈作为溶剂时，基线噪声较大，因此选择甲醇作为进样溶剂。实验进一步考察了不同浓度(60%、70%、80%、90%、100%)的甲醇水溶液对响应信号的影响，结果显示，待测组分在90%甲醇溶液中响应最好，且基线平稳，因此最终选择90%甲醇溶液作为进样溶剂。

2.3 样品前处理条件的优化

本实验分别考察了MAE与传统提取方法，如索氏提取和超声提取对提取效率的影响。结果表明3种提取方式对4种待测组分的提取效率相差不大，但与传统提取方法相比，MAE所用时间显著缩短(表1)。这是由于微波是一种超高频率的电磁波，具有很强的穿透力，它能够通过离子的偶极作用均匀、快速地对待测样品和溶剂的内部和外部同时加热，使分子的平均动能增加，从而缩短提取时间，提高实验效率[21]。因此本实验选择MAE对样品进行前处理。

表1 MAE和其它传统提取方法的比较(n=5)Table 1 Comparison of MAE with other traditional extraction methods(n=5)

实验对MAE的主要参数，如功率(400～1 000 W)、温度(90～150 ℃)和时间(1～10 min)进行了优化。结果表明，待测组分在110 ℃下600 W提取5 min时，提取效率达到最佳。本实验选择上述条件对待测组分进行提取。

2.4 迁移时间的重复性考察

ESI-IMS主要通过迁移时间的差异对待测组分进行分离和定性，因此，迁移时间的重复性对测定结果具有重要影响。本实验分别对待测组分在低、中、高3个浓度溶液中的迁移时间进行考察，每个浓度测定5次，每次间隔30 min，结果显示盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新的迁移时间分别为9.193±0.013 ms、10.327±0.014 ms、11.720±0.009 ms和12.432±0.010 ms，表明4种组分的迁移时间重现性良好。

2.5 基质效应考察

在ESI-IMS分析中，样品基质可能对测定产生干扰，从而影响分析结果的准确性。本实验选择经高效液相色谱法验证为阴性的复方罗汉果止咳颗粒作为空白对照样品，考察基质对4种待测组分的干扰情况。将复方罗汉果止咳颗粒按照“1.2.2”项下方法进行处理，得到空白基质溶液。分别用90%甲醇和空白基质溶液稀释混合对照品溶液，以“1.3”项下方法进样测定，按下列公式计算基质效应：基质效应(%)=(空白基质配制加标溶液响应值/90%甲醇配制加标溶液响应值)×100%。结果表明，样品基质对4种待测组分的测定不存在明显的基质干扰，基质效应可以忽略(表2)。

表2 4种待测组分的基质效应(n=5)Table 2 Results of matrix effect for 4 analytes(n=5)

2.6 方法学考察

将混合对照品储备液逐级稀释，配制成系列浓度的线性对照品溶液。按“1.3”项下ESI-IMS工作条件进样测定，以各待测组分的峰面积(A)为纵坐标，浓度(c，μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数(R2)。分别以信噪比(S/N)=3和S/N=10计算，得到方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果如表3所示。

表3 方法的线性实验结果和检出限Table 3 Linear relationship and limit of detection

分别精密量取低、中、高3个浓度水平的混合对照品溶液适量，置微波萃取罐中，挥干溶剂，精密加入经高效液相色谱法确认不含有4种待测化学成分的复方罗汉果止咳颗粒细粉0.1 g，按“1.2.2”项下方法制备加标供试品溶液，每个浓度制备5份，按“1.3”项下ESI-IMS工作条件进样测定，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果如表4所示。

表4 4种待测组分的加标回收率(n=5)Table 4 Results of recovery for 4 analytes(n=5)

2.7 实际样品分析

应用所建立的方法对4种中成药和2种民间偏方进行分析，结果1种民间偏方(片剂)检测出含有盐酸麻黄碱，如图5所示。其它样品中未见4种待测组分检出。 将阳性样品溶液用高效液相色谱法进一步验证，结果表明ESI-IMS法的测定结果与高效液相色谱法(HPLC)一致，如图6所示。

图5 混合对照品溶液(a)和阳性样品溶液(b)的ESI-MIS图Fig.5 ESI-IMS of standards(a) and positive sample(b) 1.ephedrine hydrochloride;2.guaifenesin;3.chlorpheniramine;4.bromhexine hydrochloride.

图6 盐酸麻黄碱对照品溶液(a)和阳性样品溶液(b)的HPLC图Fig.6 Chromatograms of ephedrine hydrochloride standard(a) and positive sample(b)1.ephedrine hydrochloride.

3 结论

本研究采用MAE技术对样品进行前处理，结合ESI-IMS技术建立了止咳平喘化痰类中成药中非法添加的4种化学成分盐酸麻黄碱、愈创甘油醚、马来酸氯苯那敏和盐酸溴己新的快速筛查方法。该方法快捷高效(只需5 min即可完成样品前处理，30 s内完成测定)、检测成本低、灵敏度高。通过对4种中成药和2种民间偏方进行筛查，其中，1种民间偏方(片剂)检测出盐酸麻黄碱，与产品宣传(纯中药组方)不符。实验结果表明，该方法适合于止咳平喘化痰类中成药中非法添加化学成分的快速筛查，同时也为其它药品及保健品中的非法添加物的监测提供了一种有效的分析手段。