细胞色素P450酶CYP3A4与双酚A的相互作用研究

张文强， 刘红艳*， 唐 琳， 谢世伟， 易忠胜， 单 杨,2

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541006； 2.湖南省农业科学院,湖南农产品加工研究所,湖南长沙 410125)

对人体内分泌系统有干扰的化学物质(EDCs)通过各种生产和生活方式排放到环境中，给环境和人类的健康带来的不利影响早已受到研究人员的关注[1]。双酚A(BPA)作为应用最广泛的内分泌干扰物之一[2]，被广泛应用于生产各种聚碳酸酯和环氧树脂等材料，比如饮料瓶，热敏纸等[3]。此外，也有研究证明BPA也可能存在于化妆品、玩具、医疗设备中[4]。BPA具有雌激素效应，会对不同的组织和器官造成损伤，如生殖系统、免疫系统和内分泌系统等[5]。因此BPA与人体之间的相互作用研究受到大家的关注。

肝脏是人体内以代谢功能为主的一个器官，在肝脏之中有许多代谢酶参与代谢，其中细胞色素P450酶(CYP)在药物代谢和外源物质的转化中起着重要作用。细胞色素P450酶的亚家族种类繁多，其中CYP3A亚家族参与了人类的50%以上的药物代谢[6]。CYP3A4是肝脏和肠道中含量最丰富的CYP酶，具有广泛的底物特异性，有研究表明它参与了睾酮和硝苯地平等的生物转化[7]。本研究通过分子对接、分子动力学模拟对游离态的CYP3A4及BPA-CYP3A4结合物进行模拟计算，探究蛋白质整体结构的变化情况，利用荧光光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、三维荧光光谱法从不同的角度去验证BPA对CYP3A4二级结构产生的影响。通过计算与光谱研究进一步阐明分子之间的结合机制，同时还可以为进一步研究细胞色素P450酶催化转化外源物质提供理论基础和参考信息，并为生物体内内分泌系统表达的酶系转化外源性化学物质的转化机制提供理论和实验基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CaryEclipse荧光分光光度计(美国，VARIAN公司)；TU-1950紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)；iS10傅立叶红外光谱仪(美国，Thermo Fisher公司)。

BPA储备液：先使用少量甲醇溶解BPA(纯度99.8%，阿拉丁公司)，后使用Tris-HCl(含0.15 mol/L NaCl)缓冲溶液稀释为1.0×10-6mol/L储备液待用。CYP3A4储备液：使用Tris-HCl(含0.15 mol/L NaCl)缓冲溶液溶解CYP3A4(Biovision公司，USA)，配制为1.0×10-5mol/L储备液待用。在本实验中，所用试剂都是分析纯，所用水都是二次蒸馏水。

1.2 荧光光谱测定

分别移取1 mL 1.0×10-6mol/L的CYP3A4溶液于10 mL的比色管中，依次加入不同体积BPA溶液，用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液定容至10 mL，分别在温度298 、303、310 K下恒温10 min后，测定200～450 nm范围内的荧光光谱变化。激发与发射狭缝宽度均为5 nm，激发波长为280 nm。

在室温条件下，检测CYP3A4、CYP3A4与BPA混合液的三维荧光光谱。激发波长是200～450 nm，发射波长是200～400 nm，激发与发射光谱带宽均为5 nm。

1.3 紫外-可见光谱测定

在298 K下，分别移取1 mL 1.0×10-6mol/L的CYP3A4溶液于10 mL比色管中，依次加入定量的BPA溶液，用pH=7.4的Tris-HCL缓冲溶液定容至10 mL，恒温保持10 min，以缓冲溶液作为背景，记录CYP3A4和BPA混合溶液在190～400 nm之间的紫外-可见光谱。

1.4 红外光谱测定

将KBr压片，使用液体涂膜法对CYP3A4、CYP3A4和BPA混合溶液进行红外光谱扫描。

1.5 分子对接与分子动力学

通过ChemBioDraw Ultra软件绘制配体(BPA)小分子结构，并进行优化。通过Autodock4.2使用拉马克遗传算法完成BPA与CYP3A4分子对接。在对接过程中，消除多余的配体和水分子，加点电荷与氢原子，盒子的大小为100 Å×100 Å×100 Å，并进行100次对接计算。从Bookhaven蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)检索受体(CYP3A4)的晶体结构(4k9t)。使用LigPlus+分析结合能最低时的构象。使用GROMACS 4.5.5软件对BPA与CYP3A4体系进行20 ns的分子动力学模拟。CYP3A4蛋白经过添加溶剂、建立盒子、添加正(负)离子等一系列处理后，然后用MM-PBSA方法对BPA-CYP3A4体系进行分析计算。

2 结果与讨论

2.1 双酚A与CYP3A4作用的荧光光谱与结合常数

图1A为BPA-CYP3A4的荧光光谱图。在温度298、303、310 K下，随着BPA的浓度升高，BPA-CYP3A4复合物的荧光强度逐渐增强，并且最大发射波长与波峰形状未发生改变。这说明BPA与CYP3A4发生了相互作用，并且使复合物的荧光强度上升。使用荧光增强方程[8]，以1/ΔF对1/[Q]作双倒数曲线图(图1B)并通过计算BPA与CYP3A4的结合常数K得表1。在3个温度下，BPA与CYP3A4的双倒数曲线呈线性关系，随着温度的上升，结合常数K值上升，表明温度对其有一定影响。在310 K时，BPA与CYP3A4的相互作用较强。

图1 310 K下BPA与CYP3A4(1.0×10-6 mol/L)相互作用的荧光光谱图(A)与双倒数曲线图(B)Fig.1 Fluorescence spectra of BPA interacted with CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) at 310 K and double reciprocal graph of three temperatures A:cBPA(1-9):0-4.5×10-10 mol/L.

2.2 双酚A与CYP3A4的键和模式

不同配体与蛋白的结合方式不同，通过计算热力学参数，可以判断其作用力类型，根据相关热力学公式[9]，计算BPA与CYP3A4结合的热力学参数列于表2。根据文献报道[10]，并结合表2，ΔG均小于0，表明BPA与CYP3A4的相互作用可以自发进行。ΔS、ΔH大于0，所以在BPA与CYP3A4的相互作用过程中，疏水作用力起了主要作用。

表1 双酚A与细胞色素CYP3A4的结合常数Table 1 The binding parameters of BPA with CYP3A4

表2 三个温度下的热力学常数Table 2 Thermodynamic constants at three temperatures

2.3 BPA对CYP3A4蛋白构象的影响

2.3.1 BPA与CYP3A4的紫外吸收光谱蛋白质中Trp和Tyr氨基酸残基的吸光度取决于其发色团的微环境，它们向波长范围两侧的偏移(即红移或蓝移)取决于周围环境的极性[11]。图2为BPA-CYP3A4的紫外吸收光谱，随着浓度的增加，吸收峰逐渐增强且伴随轻微的红移。表明CYP3A4在与BPA进行结合时，极性增加，吸收峰红移。此外，二者结合时，CYP3A4的二级结构发生了变化，肽链增长，空间位阻增加，也可导致吸收峰红移[12]。

2.3.2 红外光谱图3为BPA与CYP3A4的红外光谱图，蛋白质二级结构的特征峰大部分位于1 600～1 700 cm-1区间。其中1 610～1 640 cm-1为β-折叠，1 640～1 650 cm-1为无规则卷曲，1 650～1 658 cm-1为α-螺旋，1 660～1 680 cm-1为β-转角，1 680～1 692 cm-1为β-反向平行[13]。使用去卷积与曲线拟合对红外谱图1 600～1 700 cm-1区间进行处理，根据积分面积分析计算各个构型在蛋白质的二级结构中所占相对百分比。CYP3A4与BPA发生相互作用后，经过作用前后的分峰拟合结果分析得到，β-折叠百分比含量从1.28%上升到了1.46%；无规则卷曲的百分比含量从16.75%降到了14.36%；α-螺旋百分比含量从62.20%下降至58.63%；β-转角的百分比含量17.36%上升到22.93%；β-反向平行的百分比含量从2.41%上升到了2.62%。由此可以说明两者发生了相互作用。在图3中可以看到峰的位移和强度都发生了改变，和分峰拟合图相互印证了CYP3A4在与BPA发生相互作用后，蛋白的二级结构发生了较大的改变。

图2 BPA与CYP3A4相互作用的紫外吸收光谱图Fig.2 UV absorption spectra of BPA interacted with CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) cBPA(1-9):0.5×10-10-4.5×10-10 mol/L.

图4 CYP3A4(1.0×10-6 mol/L)(A)和BPA-CYP3A4复合物(1.0×10-6 mol/L)(B)的三维荧光光谱图Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of free CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) (A) and BPA-CYP3A4 complexes(1.0×10-6 mol/L)

2.3.3 三维荧光光谱图4显示了游离态CYP3A4(图4(A))和BPA-CYP3A4复合物(图4(B))的三维荧光光谱,将瑞利散射峰屏蔽进行分析。由图可知，在激发波长280 nm、发射波长340 nm处与激发波长225 nm、发射波长345 nm处出现两个荧光峰，随着BPA浓度增加，225/345 nm处荧光峰强度由2 109升至2 506，280/340 nm处荧光峰强度从2 419升至3 098，且均有红移现象。结果表明，在BPA和CYP3A4结合过程中，在Trp和Tyr氨基酸残基附近的微环境发生了改变，结果与红外光谱结果一致。

2.4 分子对接

分子对接技术是可以将配体与受体迅速进行结合的模拟技术[14]，使用AutoDock对BPA与CYP3A4进行分子对接。由图5可知：BPA与CYP3A4在Arg105附近的空腔进行了结合，最佳结合位点的结合能为-8.0 kcal/mol。在结合位点处，BPA周围氨基酸残基分别为：Arg105、Ile118、Ser119、Arg130、Phe137、Ile301、Phe302、Arg440、Cys442、Ile443、Gly444。这些氨基酸残基形成了对接空腔，将BPA包裹在其中。根据荧光实验的结果可知，在相互作用中，疏水作用力为主要作用力。在对接空腔位置，Ile118、Phe137、Ile301、Phe302、Ile443为疏水性氨基酸，提供疏水作用力。另外在对接位置还存在一个氢键，由Arg130残基与BPA形成，为N-O组成的氢键，距离为2.89 Å。根据荧光光谱结果可知，在BPA与CYP3A4的结合过程中疏水作用力为主要作用力，从分子对接中可以看到：除了疏水作用力外，还存在氢键作用力。

图5 BPA与CYP3A4的相互作用的分子对接与睫毛图Fig.5 Molecular docking and LigPlus+ graph of the interaction of BPA and CYP3A4

2.5 分子动力学模拟

图6为分子动力学模拟结果分析图。从图6(A)中可以看出，复合物BPA-CYP3A4的均方根偏差(RMSD)比游离态CYP3A4的RMSD低，说明在结合过程中蛋白质收缩，CYP3A4和BPA形成的复合物较为稳定。均方根波动(RMSF)是基于残基分析来观察蛋白质中氨基酸残基的柔性变化情况，由图6(B)中分析得：第130、240、442氨基酸残基附近发生了较大变化，验证了分子对接结果的准确性，即随着CYP3A4与BPA的相互结合，BPA改变了氨基酸残基附近的微环境，使之产生了较大的变化。回旋半径(Rg)用来分析蛋白整体结构的紧密程度，从图6(C)可以看出，在前10 ns，CYP3A4及BPA-CYP3A4复合物的回旋半径图谱基本一致，而10 ns之后二者之间的回旋半径发生了明显变化，说明BPA与CYP3A4产生了相互作用，使得CYP3A4的整体结构变得更加紧凑，回旋半径减小。

图6 游离态CYP3A4与复合物BPA-CYP3A4的RMSF(A)、RMSD(B)和Rg(C)Fig.6 Root mean square fluctuation(RMSF)(A)，root-mean-square displacement(RMSD)(B) and Rg(C) of free CYP3A4 and BPA-CYP3A4 complexes from 10 ns of MD simulations

3 结论

本研究通过光谱法和计算模拟方法证明了CYP3A4和BPA能发生相互作用，并进一步研究了两者的结合特征。结果表明，BPA使CYP3A4发生了荧光增强，且疏水作用为主要作用力。实验结果还表明，BPA-CYP3A4复合物的二级结构与游离的CYP3A4相比均发生了改变。另外，对接空腔位于Arg130残基附近，由Arg130残基与BPA形成。在CYP3A4和BPA结合的过程中蛋白质的二级结构发生收缩，有利于两者结合。