多壁碳纳米管滤过型净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯残留

乐 渊*， 刘春华， 尹桂豪， 王明月

(中国热带农业科学院分析测试中心，海南省热带果蔬产品质量安全 重点实验室，海南海口 571101)

氟唑菌酰胺是一种新型吡唑类杀菌剂，通过抑制病原菌内琥珀酸脱氢酶活性，阻碍呼吸作用，从而抑制病原菌的生长，具有高效、广谱、选择性好、持效久等特性[1,2]。吡唑醚菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过抑制线粒体呼吸阻止细胞色素合成来杀伤病原菌[3]。氟唑菌酰胺与吡唑醚菌酯的复配药剂常用来防治蔬菜水果中的白粉病、灰霉病、炭疽病等，也可用于防治香蕉黑星病和叶斑病等病害[4 - 6]。随着杀菌剂使用的日益广泛，其在果实中的残留状况也开始受到密切关注。国际食品法典委员会已制定氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在香蕉中的限量标准分别为3 mg/kg和0.02 mg/kg，我国也规定吡唑醚菌酯在香蕉中的限量标准为0.02 mg/kg[7]。因此，有必要开展香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的分析方法研究，为它们的使用、监管提供技术依据。

QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法因其快速、简便、适用范围广等特点，成为果蔬中农药残留分析中最常用的前处理方法[8]。N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)和石墨化炭黑(GCB)等是QuEChERS方法中最常用的吸附材料，但它们的净化效果时常令人不太满意[9]。目前新型吸附材料成为改良QuEChERS方法的研究热点。多壁碳纳米管(MWCNTs)凭借比表面积大、吸附性能好等优点受到研究者的关注，并被应用于农药残留检测领域[10,11]。将MWCNTs和无水MgSO4粉末装入针式过滤器中，采用抽提式净化方式，相比传统QuEChERS方法采用的离心分离更节省时间[12]。本研究拟采用MWCNTs滤过型净化的前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法的可分析农药范围广、灵敏度高和选择性好等特点，建立了测定香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯残留量的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TripleQuad 4500超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)(美国，AB SCIEX公司)；ACQUITY UPLC液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(美国，WATERS公司)；VS-24SMTi型高速冷冻离心机(美国，VISION公司)；MJ-PB12Power304型破壁机(美的公司)。

氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯农药标准品浓度均为1 000 mg/L(农业农村部环境保护科研监测所)；甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国Fisher公司)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、十八烷基键合硅胶(C18)吸附剂、石墨化炭黑(GCB)吸附剂(美国Agilent公司)；MWCNTs滤过型净化柱(m-PFC，天津博纳艾杰尔科技有限公司)，内有10 mg MWCNTs(外径10～20 nm，内径5 nm，长度5～15 μm)和150 mg无水MgSO4；无水MgSO4、NaCl、NaAc、HAc(广州化学试剂厂)；二水柠檬酸钠和柠檬酸二钠盐倍半水合物(上海阿拉丁公司)。实验用水为经Milli-Q净化系统0.22 μm过滤膜过滤的纯化水。

香蕉样品购自本地超市和水果批发市场。

1.2 标准溶液的配制

分别吸取1 mL氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯标准溶液于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成浓度为100 mg/L的2种农药的混合标准储备液，储存于-18 ℃冰箱。然后用乙腈进行逐级稀释，配制成浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L的系列混合标准溶液。

取空白香蕉样品按1.3方法进行前处理，得到空白香蕉基质溶液。取0.5 mL净化，氮吹至近干后，用0.5 mL相应浓度乙腈配制的混合标准溶液定容，得到基质匹配标准溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

香蕉样品(分为全蕉和蕉肉两份)用破壁机搅碎，装入洁净容器内，作为试样密封并于-18 ℃下保存。准确称取10.00 g均质试样于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈、4.0 g无水MgSO4、1.0 g NaCl和1粒陶瓷均质子，剧烈振摇1 min。然后以5 000 r/min的转速离心5 min。取上清液1.00 mL于2 mL离心管中，待净化。将2.5 mL注射器与多壁碳纳米管滤过型净化柱(m-PFC)连接，向上抽，使所有待净化液经过净化柱，再推出至离心管中，样品提取液第二次经过吸附剂部分，重复操作1次。净化后的提取液经0.22 μm微孔膜过滤，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 仪器工作条件

TripleQuad 4500色谱条件：ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美国Waters公司)；流动相：A为含5 mmol/L NH4Ac溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.50 min，10%B；0.50～3.00 min，10%～95%B；3.00～5.00 min，95%B；5.00～5.01 min，95%～10%B；5.01～6.00 min，10%B。流速：0.25 mL/min。柱温：35 ℃；样品室温度：15 ℃；进样体积：3 μL。

TripleQuad 4500质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子扫描；扫描方式：多反应监测(MRM)；温度：550 ℃；气帘气：氮气，206.8 kPa；喷雾气：氮气，379.2 kPa；辅助加热气：氮气，379.2 kPa；碰撞气：氮气，55.2 kPa。MRM模式下的质谱参数见表1。

表1 MRM分析的质谱参数Table 1 MS parameters under MRM mode

ACQUITY UPLC液相色谱仪条件：ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美国Waters公司)；流动相：A为含5 mmol/L NH4Ac溶液，B为乙腈/甲醇=3/1(体积比)；梯度洗脱程序：0～0.50 min，75%B；0.50～2.50 min，75%～99%B；2.50～8.00 min，99%B；8.00～9.00 min，99%～75%B；9.01～10.00 min，75%B。流速：0.25 mL/min。柱温：35 ℃；样品室温度：20 ℃；进样体积：3 μL；二极管阵列检测器检测波长：450 nm。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS/MS工作条件的优化

在电喷雾电离模式下，以直接进样方式分别对1.0 mg/L氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的单标溶液进行母离子全扫描，确定分子离子峰，并对其子离子进行全扫描，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对。其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对，另一对作为定性离子对。随后进行其他质谱参数的优化，结果见表1。在优化质谱条件下，分别试验了甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液和乙腈-水6种流动相体系。结果表明，以甲醇和含5 mmol/L NH4Ac溶液作为流动相时，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的响应值最大，并且可获得较好的分离度。实验采用甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液作为流动相。图1为MRM模式下标准溶液的提取离子色谱图。

2.2 提取条件的选择

为改善一些对pH值较为敏感农药的检测，QuEChERS法常在提取试剂中加入乙酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系[13，14]。本实验尝试了在提取过程中加入上述两种缓冲盐体系，与不添加缓冲盐的纯乙腈溶液进行提取效果比较。添加水平为50 μg/kg，按文献方法[13,14]和1.3节操作。结果显示3种条件下，吡唑醚菌酯的提取效率分别为84.4%、91.5%和102%。实验选择纯乙腈作为提取溶剂，不添加缓冲盐。

图2 四种条件净化香蕉提取液的超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(PDA)色谱图Fig.2 UPLC-PDA chromatograms showing removal of pigments from banana extracts using the four cleanup protocols

2.3 净化条件的选择

实验考察了PSA、C18、GCB和m-PFC对全蕉(颜色比蕉肉更深)乙腈提取液的净化效果。分别取1 mL全蕉提取液，用4种条件净化：(1)50 mg PSA+150 mg无水MgSO4；(2)50 mg C18+150 mg无水MgSO4；(3)50 mg GCB+150 mg无水MgSO4：(4)m-PFC(10 mg MWCNTs+150 mg无水MgSO4)。参照文献[15]对色素净化效果进行考察，结果如图2所示。与PSA和C18相比，m-PFC净化效果更好，原因可能是MWCNTs比表面积更大，还具有中空结构。因此实验选择m-PFC作为净化条件。

实验还考察了m-PFC净化次数对净化效果的影响。结果表明，净化次数对氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的回收率影响不大；与净化1次相比，净化2次、3次和4次时，相对标准偏差较小，原因可能是净化次数增加有利于吸附材料与提取液充分接触。实验过程中，净化第3次和第4次时，净化柱抽提比较费劲、耗时也较长，原因可能是无水MgSO4遇提取液中微量水份后结块，导致柱压升高。综合考虑，实验选择净化2次。

2.4 方法的线性范围和检出限

移取一定量的氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯标准溶液，以空白全蕉和蕉肉基质提取液为稀释溶液配制标准曲线，采用1.4中方法进行测定，以仪器响应峰面积对目标物的质量浓度进行线性回归。结果表明，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的质量浓度在0.005～0.2 mg/L范围内线性良好，相关系数和回归方程见表2。以满足方法学要求的最低添加回收水平作为定量限(LOQ)，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中的定量限均为5 μg/kg。

2.5 基质效应

本文通过测定氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在基质标准工作液中校正曲线的斜率(A)及其在乙腈标准工作液中校正曲线的斜率(B)，得到基质效应(ME)=(A-B)/B×100%。若ME>0，表示基质增强效应；若ME<0，表示基质抑制效应。表3为氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中的基质效应。结果表明氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中均表现为抑制效应。在农药残留检测领域，常采用使用分析保护试剂、标准加入法、同位素内标法、样品稀释和基质匹配标准溶液等消除基质效应带来的影响[16 - 18]。由于空白基质相对容易获取，本实验采用基质标准工作液进行定量分析来提高结果的准确度。

2.6 方法的精密度和回收率

取空白全蕉和蕉肉样品，按5、10、50 μg/kg 3个水平进行加标实验，按1.3方法进行前处理，每个平行测定6次，作回收率和精密度实验。结果(表3)显示，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的平均回收率在74.7%～102%之间，相对标准偏差(RSD)在1.1%～8.2%之间，满足农药残留分析方法要求[19]。

表3 方法平均回收率、相对标准偏差(n=6)及基质效应Table 3 Average recovery,relative standard deviation(n=6) and matrix effect of the method

2.7 实际样品的测定

采用本实验建立的方法测定了3个超市和1个水果批发市场的16份香蕉样品，其中1份全蕉样品检出氟唑菌酰胺，含量为0.087 mg/kg；1份全蕉样品检出吡唑醚菌酯，含量为0.015 mg/kg。检测结果均低于国际食品法典委员会和我国限量标准。相应的蕉肉样品中未检出氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯。其余样品均未检出氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱同时分析香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯残留量的方法。采用多壁碳纳米管滤过型净化柱净化，具有比PSA、C18和GCB等吸附材料更好的净化效果。通过优化仪器条件、提取条件和净化条件等，实现了氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的有效提取、净化和色谱分离。方法学考察及实际样品测定证明该方法具有简便、净化效果好和准确度高等优点，可用于香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯残留量的快速检测，具有一定的推广价值。