高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠肝脏中S -腺苷甲硫氨酸和S -腺苷同型半胱氨酸

张 宁， 汪文龙， 李韵晴， 王新航， 司露露， 唐 深， 陆彩玲， 秦 富*， 李习艺*

(1.广西医科大学公共卫生学院，广西南宁 530021； 2.南宁海关技术中心，广西南宁 530021； 3.广西医科大学基础医学院，广西南宁 530021)

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)是蛋氨酸的活性形式，为机体内重要的甲基供体[1]，参与DNA、RNA、脂质和神经递质等化合物的甲基化反应。SAM在ATP的参与下由蛋氨酸腺苷转移酶催化生成蛋氨酸[2]，同时在甲基转移酶的作用下通过甲基化反应生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine，SAH)[3]。DNA甲基化在肝脏疾病的发生发展中发挥着重要作用，通过调控与肝细胞内脂质代谢和炎症反应等相关的基因与蛋白的表达影响肝脏疾病的发展进程[4]。研究表明，慢性乙醇暴露使蛋氨酸合成酶活性降低，使肝脏中SAM含量下降，SAM/SAH比值下降，DNA甲基化水平降低，最终引起肝脏损伤[5,6]。在高脂饮食构建的非酒精性脂肪肝动物模型中，非酒精性脂肪肝大鼠与正常组相比，SAM水平下降16%，SAM/SAH比值下降66%；通过叶酸干预后，发现肝脏内SAM水平恢复至对照组水平，SAM/SAH比值增加，肝脏整体DNA甲基化水平上升[7]，从而起到保护肝脏的作用。肝细胞内SAM浓度和DNA甲基化水平存在相关性，通过营养干预机体内SAM和SAH含量来调控DNA甲基化过程以降低肝脏患病风险。SAM和SAH作为转甲基化反应的重要角色，其比值常用作细胞内甲基化潜能的相对指标，是甲基化代谢研究中最常用的指标。

目前，生物样本中SAM和SAH含量检测主要采用液相色谱-紫外检测法(LC-UV)[8,9]、电化学发光法[10]、离子交换色谱法[11]、免疫检测法[12]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[13 - 15]。LC-MS/MS法灵敏度和特异性均较好，可以满足SAM和SAH含量高低不同的血液、细胞、肝脏等生物样本。然而，目前文献报道方法的检测对象多为血液样本，采用固相萃取[13,15]或蛋白质预沉淀[16]等前处理方法，存在样本用量较大，操作复杂，检测不够灵敏等缺点。本研究建立了HPLC-MS/MS法同时检测大鼠肝脏中SAM和SAH的含量，方法前处理简单、样品用量少、灵敏度高、特异性强，适于检测大鼠肝脏中SAM和SAH含量，为血液、细胞等其他生物样本中SAM和SAH含量测定提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

QTRAP 4500高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱仪(美国，AB SCIEX公司)；ML204电子天平(瑞士，Mettler toledo公司)；KL512J氮气浓缩装置(北京康林科技有限公司)；SA300多功能振荡器(日本，Yamato公司)；手动研磨匀浆器OSE-Y20(北京TIANGEN公司)。

SAM标准品购自中国MACKLIN公司，纯度≥97.5%；SAH标准品购自美国Cayman公司，纯度≥98.0%。甲醇、HAc、NH4Ac均为色谱纯，HCl为分析纯，均购自美国Tedia公司。用0.1 mol/L的HCl分别配制浓度为2.0 g/L的SAM和SAH标准储备液，使用初始流动相配制200 μg/mL SAM和20 μg/mL SAH混合标准溶液。水由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备。

1.2 样品采集与处理

称取约0.02 g(精确至0.0001 g) SPF级幼年(8周龄)SD大鼠(平均体重62.13 g，广西医科大学动物实验中心提供)的肝脏样品，置于1.5 mL EP管中，用手持匀浆器将肝脏组织充分研磨匀浆；加入1 mL提取液(5.0 mmol/L NH4Ac+0.4%乙酸+2%甲醇)，涡旋振荡1 min后，全部转入15 mL离心管中，洗涤EP管3次，每次1 mL，洗液合并至上述15 mL离心管中，振荡提取10 min；于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，将上清液转至另一洁净离心管中，残渣用5 mL提取液再振荡提取10 min；于4 ℃、10 000 r/min，离心10 min，将上清液合并至上述洁净离心管中，用提取液定容至10 mL，混匀后取1 mL通过有机相滤膜后装瓶。

1.3 分析条件

色谱条件：CORTES UPLC-C18+色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm；美国Waters公司)；流动相A：5.0 mmol/L NH4Ac和0.4%HAc溶液；流动相B：甲醇；洗脱程序为：0～1 min，98%A；1～3 min，25%A；3～4 min，98%A；4～6 min，98%A。柱温：40 ℃；流速：0.35 mL/min；进样体积：2.0 μL。

质谱条件：多反应监测(MRM)模式扫描；电喷雾电离正离子模式(ESI+)；CUR：206 kPa； Collision Gas(CAD)：Medium；IonSpray Voltage(IS)：5 500 V；Temperature(TEM)：500 ℃；GS1：384 kPa； GS2：384 kPa。

1.4 统计学方法

使用统计软件SPSS 17.0采用t检验对检测数据进行统计分析，当p<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数优化

对SAM和SAH进行ESI+模式下的选择离子监测扫描，通过优化各种化合物的去簇电压和碰撞能量等质谱条件，选择响应较强、干扰较小的1个母离子和2个子离子。其中SAH以[M+H]+加合方式为最强峰，而SAM在m/z399.2处出现最强峰，可能是SAM在电喷雾离子源作用下失去2个中性离子再以[M+H]+加合方式产生带电离子。SAM和SAH多反应监测的质谱参数见表1，质谱图见图1。

表1 SAM和SAH的质谱参数及保留时间Table 1 MS parameters and retention times (tR) of SAM and SAH

图1 SAM(A)和SAH(B)的质谱图Fig.1 Mass spectra of SAM(A) and SAH(B)

2.2 流动相的确定

以甲醇为有机相，0%、0.1%、0.2%、0.4%和0.8%HAc溶液(pH值分别为6.4、4.2、3.9、3.6和3.3)为水相对SAM和SAH进行分离，如图2所示。随着水相pH值逐渐降低，SAM的峰宽逐渐变窄、丰度逐渐增强，当HAc含量为0.4%时峰形和峰高均达到最佳，此时pH值接近最适pH=3.4[17]。因为SAM呈弱碱性，且稳定性差，所以在流动相中添加H+使SAM呈离子态，可以增强其稳定性和洗脱效果。然后以含0.4%HAc和不同浓度NH4Ac(0、5.0、10.0和20.0 mmol/L)溶液为水相分析NH4Ac对SAM和SAH分离效果的影响。结果如图3所示，添加NH4Ac可以延长SAM和SAH在色谱柱上的保留时间，但SAM的峰宽逐渐变宽、丰度逐渐下降；当NH4Ac浓度为5.0 mmol/L时，SAM和SAH的保留效果和色谱峰形均较好。这是因为SAM为极性氨基酸，在反向色谱柱上保留效果弱，通过在流动相中添加NH4Ac可以增强其保留效果，但NH4Ac浓度过高时会影响洗脱效果导致峰宽增大甚至拖尾现象。最后以含有5.0 mmol/L NH4Ac和0.4%HAc溶液为水相，比较甲醇和乙腈作为有机相时SAM和SAH的分离效果，以甲醇为有机相时，峰形和保留效果都明显优于乙腈，因此最终选用甲醇和含有5.0 mmol/L NH4Ac和0.4%HAc溶液作为本方法的流动相。由于SAM的极性相对较强，初始流动相需要较高比例的水相才能获得较好的保留效果，所以本研究选择98%水相为初始流动相，并在此基础上对梯度洗脱程序进行了优化。

图2 不同pH流动相条件下SAM的色谱峰强度Fig.2 Chromatographic peak intensity of SAM at different pH mobile phases

图3 含不同浓度NH4Ac流动相条件下SAM和SAH色谱图Fig.3 Chromatograms of SAM and SAH in mobile phase with different concentrations of NH4Ac

2.3 提取效率的分析

本研究尝试使用甲醇提取，氮气吹干，初始流动相定容的方法处理肝脏组织，结果SAM的提取效率极差，响应值较低。这是因为SAM的极性较强，易溶于水而难溶于有机溶剂，而SAH极性较弱，使用有机相提取也可以有较好的效果。若单独检测分析SAH则可以使用甲醇作为提取液，通过进一步浓缩后可以达到更低的检测限，适用于SAH含量低的其它生物样本检测。由于大鼠肝脏中SAM和SAH的含量均较高，难以进行加标回收试验分析，因此采用连续多次提取的方法来分析提取效率，即对同一份肝脏样品连续提取3次，测定每次提取液中SAM和SAH的浓度。结果显示，第二次和第三次提取SAM含量分别占第一次提取量的4.51%和0.06%；第二次和第三次提取SAH含量分别占第一次提取量的10.08%和1.23%，因此使用初始流动相对肝脏样品中SAM和SAH进行连续两次提取的处理方法。

2.4 定量限的确定

分别对不同浓度SAM(0、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL)和SAH(0、0.05、0.1、0.2、0.5 ng/mL)标准溶液进样分析，以满足信噪比(S/N)≥10的最低浓度作为仪器定量限(LOQ)，SAM和SAH定量限分别是5.0 ng/mL和0.5 ng/mL，根据样品前处理方法确定方法定量限分别为250 ng/g和25 ng/g。由于无法对肝脏样品中SAM和SAH的回收率进行分析，所以方法的定量限未考虑回收率的影响。另外，本使用10 mL提取液处理0.2 g肝脏样品，稀释倍数较大，若减少提取液用量可以降低方法的定量限从而提高方法的灵敏度，以满足SAM和SAH含量较低的生物样本检测，如血清中SAM和SAH浓度的测定。

2.5 大鼠肝脏中SAM和SAH检测结果

用初始流动相配制SAM-SAH系列混合标准工作液(0.1～0.01、0.2～0.02、0.5～0.05、1.0～0.1和2.0～0.2 μg/mL)，建立标准曲线。结果SAM和SAH的线性回归方程分别是：y=9.1×104x-4056.2和y=3.8×105x-899.8。相关系数R2分别是0.997和0.999。用该方法平行测定SD大鼠肝脏样品6次，结果幼年组大鼠肝脏中SAM和SAH含量分别为86.34±5.54 μg/g和17.73±2.24 μg/g，相对标准偏差分别是6.4%和11.5%。采用本方法测得大鼠肝脏中SAM和SAH的浓度异于文献报道[7,8]中的结果，可能是由于实验动物的品系、年龄、处理方法或检测方法等原因引起的差异。采用本方法测得SD大鼠肝脏中SAM和SAH的含量与Bakir[7]等采用HPLC法对Wistar大鼠测定的含量(40 μg/g和5.7 μg/g)基本一致。

2.6 方法初步应用

在我们前期的研究中，对7只年轻组(5月龄，平均体重535.8 g)大鼠和5只老年组(27月龄，平均体重725.8 g)大鼠肝脏中去甲基化PP2Ac蛋白水平进行检测，结果显示老年组大鼠与年轻组大鼠相比，PP2Ac去甲基化蛋白表达量明显降低[17]。为了研究大鼠肝脏中PP2Ac甲基化水平与SAM和SAH代谢水平的关系，我们对这两组大鼠肝脏中SAM和SAH含量进行测定。结果显示年轻组肝脏组织中SAM和SAH的含量分别为8.07±3.73 μg/g和9.08±2.21 μg/g，SAM/SAH值为0.87；老年组大鼠肝脏组织中SAM和SAH含量分别是16.52±2.21 μg/g和6.68±1.26 μg/g，SAM/SAH值为2.56。结果如图4所示，提示老年组大鼠的肝脏组织中相关DNA或蛋白质的甲基化水平较年轻组高，这与我们前期的研究结果相一致。

图4 (A)年轻组和老年组大鼠肝脏中SAM和SAH浓度值;(B)年轻组和老年组大鼠肝脏中SAM/SAH值(*表示p<0.05)Fig.4 (A) SAM and SAH concentrations in the liver of young and old rats;(B) the values of SAM/SAH in the liver of young and old rats

3 结论

本研究以大鼠肝脏组织为样本，分析其中的SAM和SAH含量，成功建立了同时检测大鼠肝脏中SAM和SAH的HPLC-MS/MS法。方法前处理简单快速、灵敏度高、特异性强，适合准确测定实验动物肝脏中SAM和SAH的含量，为血液、细胞、脑组织等其他生物样品中SAM和SAH含量的测定提供可靠的方法学支持。