CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs双发射比率荧光探针的构建及在测定生物样品中Cu(Ⅱ)的应用

俱玉云， 陈永雷， 陈兴国

(兰州大学化学化工学院，甘肃兰州 730000)

Cu(Ⅱ)的重要作用之一是作为很多生理反应中酶的辅因子以及威尔森氏病、阿兹海默症等疾病的诊断标准[1]。然而，Cu(Ⅱ)浓度较高时会导致婴儿肝损伤及儿童肝硬化等，对人体健康具有危害性[2]。随着铜在工业中的广泛使用，铜含量对人类健康的影响及其测定方法引起了人们越来越多的关注[3 - 5]。目前，测定Cu(Ⅱ)的方法主要有原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、电化学等方法[6]。近年来，荧光化学传感器由于其高灵敏度、高选择性、操作简单等优点日益受到人们关注。然而，大多数荧光化学传感器的荧光强度虽然会随着Cu(Ⅱ)浓度的变化增强或减弱，但这种单一的以强度变化测定Cu(Ⅱ)的方法通常会受到传感器浓度(物质)、检测器或光源的稳定性、复杂样品基质中共存组分等的干扰或者影响。双发射比率荧光方法通过比率荧光来检测目标物则可避免上述问题的影响[7 - 8]。然而受限于不同种类的荧光类物质的寻找及设计，该类探针的报道相对较少。近年来，碳量子点(CQDs)由于其良好的水溶性、光稳定性、生物相容性、低毒性等优点备受人们瞩目[9 - 11]。虽然CQDs由于具备分子识别作用而被用于化学传感器[12 - 18]，但是将CQDs用于比率荧光探针的构建，并进一步用于生物样品检测方面的研究仍相对较少。与有机荧光类物质相比，CQDs用于比率荧光探针的构建不需要复杂的合成过程。Zhou等[8]提出了基于CQDs为荧光输出信号的双发射荧光探针测定Cu(Ⅱ)，但该CQDs对Cu(Ⅱ)没有识别作用，所以需要修饰一种对Cu(Ⅱ)有识别作用的有机分子，导致制备过程复杂。

图1 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs检测Cu(Ⅱ)的原理Fig.1 Schematic Illustration of the CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs for Sensing of Cu(Ⅱ)

本文通过一锅法制备了CdS掺杂的CdTe红光量子点(CdTe/CdS)[19]，通过柠檬酸和聚乙烯亚胺(BPEI)热裂解制备了蓝光CQDs[12]。利用硅酸乙酯水解制备SiO2微球并将CdTe/CdS包裹在该SiO2球内[20]，进一步将上述蓝光CQDs连接在SiO2球表面，成功制备了双发射比率荧光探针(CdTe/CdS@-BPEI-CQDs)，并将其用于检测人体尿液及血浆中的Cu(Ⅱ)。该探针检测Cu(Ⅱ)的原理见图1。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

所制备的样品形貌及尺寸由Hitachi-6000透射电子显微镜(TEM)(日本，日立)进行表征。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)通过Nicolet Nexus 670傅里叶变换红外光谱仪来测定。RF-5301PC荧光光谱仪(日本,岛津)用于测定体系的荧光光谱，激发波长为365 nm，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm。

巯基丙酸(MPA)、NaBH4、聚乙烯亚胺(BPEI)购于百灵威试剂公司。CdCl2、Na2TeO3、NaOH、硅酸乙酯、柠檬酸钠均购自天津光复精细化工研究所，实验所用试剂均为分析纯。AXLM 1820-V AXL 净水器用于制备超纯水。

1.2 CdTe/CdS红光量子点的合成

将74 μL的MPA加入至100 mL CdCl2溶液中(0.5 mmol) 并搅拌混匀。将20 mg柠檬酸钠加入该混合溶液中，搅拌10 min后，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH为11.2，加入4.4 mg Na2TeO3及20 mg NaBH4、搅拌至溶解完全并缓慢加热到90 ℃，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，将下层固体分散于5 mL乙醇中，备用。

1.3 CdTe/CdS@SiO2的合成

移取2 mL CdTe/CdS量子点溶液分散于100 mL 水和乙醇混合液中(水∶乙醇=1∶4)，超声至分散均匀。40 ℃下加入4.6 mL浓氨水、460 μL硅酸乙酯，恒温加热3 h。冷却后离心分离，用乙醇和水交替洗涤，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2，自然晾干后，备用。

1.4 BPEI-CQDs的合成

将0.5 g 聚乙烯亚胺及1.0 g柠檬酸溶解于含有10 mL 超纯水的25 mL烧杯中，慢慢加热至接近200 ℃，恒温20 min使溶液的颜色变为淡黄色，继续加入1 mL超纯水，重复操作10次，溶液颜色变为橘黄色时表明形成了BPEI-CQDs。用超纯水稀释至10 mL，0.01 mol/L盐酸过柱纯化。将得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs，于真空干燥箱40 ℃烘干[12]。

1.5 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成

将0.12 g CdTe/CdS@SiO2溶解于120 mL乙醇中，加入25.5 mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至 60 ℃，加入225 μL硅酸乙酯及225 μL异腈酸酯，60 ℃恒温6 h。冷却后离心，将所得固体用乙醇和超纯水交替洗后，自然晾干得到CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs。

1.6 Cu(Ⅱ)的测定方法

依次加入2.47 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)，20 μL 50 mg/mL的探针储备液(CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs)，10 μL样品溶液于比色池中混匀。反应2 min后，在荧光仪上测定溶液荧光光谱，根据工作曲线确定Cu(Ⅱ)的含量。

1.7 样品处理

取健康女志愿者尿液1.0 mL，加入0.1 mL浓HNO3酸化，12 000 r/min离心10 min，取1.0 mL上清液用超纯水稀释至50 mL备用。从冰箱中取出血浆于室温下解冻，按上述方法酸化、去蛋白后稀释至一定体积备用。

2 结果与讨论

2.1 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs荧光探针的表征

图2A为CdTe/CdS@SiO2的透射电镜(TEM)图，结果表明大量的CdTe/CdS QDs被成功包覆在SiO2微球内。图2B为CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的TEM图。图3A为该荧光探针的X-射线光电子能谱(XPS)图，图3B、3C、3D分别为C 1s、N 1s、O 1s的高分辨谱，表明该CQDs被成功修饰在SiO2层表面。

图2 CdTe/CdS@SiO2(A)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(B)的透射电镜(TEM)图Fig.2 TEM image of CdTe/CdS@SiO2(A) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(B)

图3 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的X-射线光电子能谱(XPS)(A)图和C 1s(B)、N 1s(C)和O 1s(D)的高分辨XPS图Fig.3 XPS of (A) and high resolution XPS,C 1s (B),N 1s (C),and O 1s (D) of the CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs,respectively

在365 nm光激发下，CdTe/CdS QDs的荧光发射光谱波长位于656 nm，包覆一层SiO2后其发射光谱发生蓝移[21]，在653 nm处发射很强的荧光。利用SiO2微球表面的-OH与BPEI-CQDs表面-NH2的静电作用，在异腈酸酯存在下发生脱水作用，成功制备了CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs双发射荧光纳米探针(图4)。在365 nm激发下，该探针的荧光发射光谱分别位于450 nm、650 nm，表明BPEI-CQDs被成功修饰到SiO2层上。图5a为BPEI-CQDs的红外(IR)光谱图，3 440和1 585 cm-1处的N-H键的伸缩振动峰,1 122 cm-1处的C-N键的伸缩振动峰为聚乙烯亚胺的特征吸收峰。1 700 cm-1处尖锐的吸收峰对应于酰胺键(-CONH-)的吸收峰。图5b为CdTe/CdS@SiO2的IR光谱图，3 425 cm-1处的峰对应于-OH的伸缩振动峰。图5c 为CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的IR光谱图，1 700 cm-1处的较弱的尖锐吸收峰对应于酰胺键的吸收峰，1 585 cm-1处的N-H键的伸缩振动峰表明BPEI-CQDs被成功修饰到SiO2微球层上。

2.2 检测机理

双发射荧光探针对于Cu(Ⅱ)的响应如图6所示，在365 nm单一激发波长下，该荧光探针在450 nm、650 nm处的荧光发射光谱分别对应于BPEI-CQDs发射的蓝光，及嵌入在SiO2球内的CdTe/CdS QDs发出的红光。随着Cu(Ⅱ)的加入，SiO2层内部CdTe/CdS红光量子点的发射光强度保持不变，而450 nm处蓝光强度出现持续的猝灭，表明该探针对于Cu(Ⅱ)有较好的响应。

2.3 pH影响

考察了不同pH时Cu(Ⅱ)对该双发射荧光探针猝猝灭效率的影响(图7)。结果表明，当pH在4～6之间时，荧光探针的荧光强度较强(黑色)，当体系pH值过高或过低时，荧光强度均有所降低。图7中灰色柱状表明，酸性条件下(pH ≤ 3.0)Cu(Ⅱ)对荧光探针的荧光猝灭作用很小，可能原因为酸性条件下探针表面CQDs的-NH2发生质子化，无法与Cu(Ⅱ)发生络合反应形成铜胺配合物。在碱性条件下(pH >7.0)猝灭效率也较低，可能原因为Cu(Ⅱ)发生水解抑制了Cu(Ⅱ)与CQDs表面-NH2的络合反应。当pH在4～7范围内变化时，猝灭效率较高，且当pH在5～7之间变化时，荧光探针具有较好的稳定性。综合考虑pH对探针稳定性、荧光猝灭效率的影响，以及该探针用于生物样品等原因，选择10 mmol/L PBS(pH=7.4)作为缓冲溶液。

图4 CdTe/CdS(a)、CdTe/CdS@SiO2(b)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)荧光发射光谱Fig.4 Fluorescence emission spectra of CdTe/CdS(a),CdTe/CdS@SiO2(b) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)

图5 BPEI-CQDs(a)、CdTe/CdS@SiO2(b)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)的红外(IR)光谱图Fig.5 FT-IR spectra of BPEI-CQDs(a),CdTe/CdS@-SiO2(b) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)

图6 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs对Cu(Ⅱ)的响应Fig.6 Fluorescence emission spectra of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu(Ⅱ)

2.4 稳定性考察

在10 mmol/L PBS(pH=7.4)中考察了NaCl浓度对F450/F650的影响(图8A)。由图可知，NaCl浓度在1.0×10-7～1.0 mol/L内变化时，F450/F650保持不变。实验还考察了光照时间对F450/F650的影响(图8B)，表明在120 min内F450/F650没有明显降低。表明了该双发射荧光探针在苛刻条件下的高稳定性[22]。

图8 NaCl 浓度(A)和365 nm光照时间(B)对F450/F650的影响Fig.8 Effects of NaCl concentration(A) and illumination time(B) at λ=365 nm on F450/F650

2.5 选择性实验

在Cu(Ⅱ)浓度为60 μmol/L的情况下，考察了金属离子Hg2+、Cd2+、Mn2+、Fe3+、Ba2+、Al3+、Ca2+、Li+、Mg2+、Na+、K+、Pb2+(10倍)对该探针检测Cu(Ⅱ)的干扰(图9A)。结果表明，与未加入金属离子的F450/F650相比，加入其它金属离子后的F450/F650没有发生明显的变化(红色)。进一步将Cu(Ⅱ)加入到含有其它金属离子的探针溶液中后，F450/F650明显降低，表明这些共存的金属离子对该双发射荧光探针检测Cu(Ⅱ)几乎没有影响(绿色)，进一步表明该探针对Cu(Ⅱ)的高选择性。

在Cu(Ⅱ)浓度为60 μmol/L的情况下，考察了Trp、Glu、Ser、Ala、His、Arg、Lys、Cys、Glucose、GSH(10倍)对该探针检测Cu(Ⅱ)的干扰。如图9B所示，加入这些氨基酸后该探针的F450/F650比值发生很小的变化(红色)。然而，进一步将Cu(Ⅱ)加入到含有这些氨基酸的探针溶液中，F450/F650发生了明显降低，表明氨基酸等物质对该双发射探针检测Cu(Ⅱ)几乎没有干扰(绿色)。上述结果表明该体系具有很好的抗干扰能力，能对Cu(Ⅱ)进行选择性检测。

图9 金属离子(A)和氨基酸(B)对F450/F650的影响Fig.9 Effects of metal ions(A) and amino acids(B) on F450/F650

2.6 方法性能

在最佳条件下对该方法的性能进行了考察，结果如图10所示。对Cu(Ⅱ)的响应范围为0～90 μmol/L，当Cu(Ⅱ)加入量大于90 μmol/L时，450 nm处的荧光强度不再发生变化(图10A)。实验结果还表明，F450/F650与Cu(Ⅱ)的浓度存在良好的线性关系(图10B)，线性范围为0.40～70 μmol/L，其线性回归方程为：F450/F650=2.150-0.0239c(μmol/L)，R2=0.994，检测限为0.27 μmol/L，低于美国环境保护局对饮用水中Cu(Ⅱ)含量的要求(1.3 ppm，约为20 μmol/L)。随着Cu(Ⅱ)加入量的增加，450 nm、650 nm处发射光谱强度的变化导致探针溶液在荧光灯下颜色的不断变化，如图10C所示。

图10 Cu(Ⅱ)浓度对探针荧光的影响(A)、工作曲线(B)和相应的探针溶液的颜色变化(C)Fig.10 Fluorescence responses of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu(Ⅱ)(from top to bottom,0,0.4,1,5,10,20,40,60,70,80,and 90 μmol/L) in a pH=7.4 PBS solution(A),calibration curve(B) and photographs of the color change of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs solution(C)

2.7 样品分析

为了验证该方法的可行性，将该双发射荧光探针分别用于检测人体尿样及血浆中Cu(Ⅱ)的含量，通过加标回收的方法对该方法准确度进行了考察，结果列于表1中。可以看出回收率均在103%～105%之间，三次平行实验的相对标准偏差(RSD)均低于5%。

表1 人尿液及血液中Cu(Ⅱ)的测定结果(n=3)

3 结论

通过将对Cu(Ⅱ)有选择性识别作用的BPEI-CQDs与被SiO2包裹的红光量子点CdTe/CdS相结合，构建了一种新型双发射比率荧光探针。该探针在单一光源照射下可以发射出两种不同的荧光。基于Cu(Ⅱ) 与探针表面的BPEI-CQDs的相互作用导致其荧光猝灭的现象，可以选择性的测定Cu(Ⅱ)。该双发射荧光探针已被成功用于人体尿液及血浆中Cu(Ⅱ)的测定。