pH响应型近红外菁类荧光探针的合成及细胞成像

时间：2024-09-03

赵旭, 陈立功, 严秀平*,3

(1.食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江南大学食品学院分析食品安全学研究所，江苏无锡 214122；2.天津大学化工学院，天津 300072;3.天津化学化工协同创新中心，天津 300071)

多年来，尽管众多科研人员致力于肿瘤的产生和转移机制的研究，且已取得了重要进展，但面对晚期癌症尚无安全有效的治疗方法[1]。癌症的早期诊治是提高癌症患者治愈率的关键，也是亟需解决的问题。因此，研发特异性强、灵敏度高的检测技术用于肿瘤早期诊断是十分必要的。光学成像技术具有非侵袭性、实时、灵敏度高、操作简单以及可视性强等诸多优势，已成为肿瘤检测的较理想方法[2]。尤其是近红外荧光成像技术，因其吸收和发射波长均处于生物光学成像窗口内，具有组织穿透能力强、生物组织的光吸收及自发荧光干扰小等优势而倍受青睐[3 - 5]。但传统的成像探针大多为“always on”型显影剂，一直处于荧光激活状态的显影剂在体内代谢转运过程中始终显示出荧光信号，易造成自身背景干扰及“假阳性”结果[6]。基于肿瘤细胞弱酸性这一特性设计的pH激活型“off-on”可逆显影剂，很大程度上避免了传统“always on”型显影剂存在的诸多不足，具有很高的信噪比，为肿瘤特异性成像带来了福音[7 - 9]。

与正常细胞相比，肿瘤细胞中葡萄糖转运体的表达和活性明显增强。这一特性使得糖类物质在肿瘤靶向显影领域备受关注，并取得了较理想的实验效果[10 - 11]。此外，引入糖类物质可增强化合物的生物相容性及水溶性。因此，在结构设计时引入糖基是一种较好的选择。我们设计合成了pH激活型近红外不对称菁类荧光探针，并选用氨基葡萄糖作为修饰基团以增强探针的水溶性及生物相容性，并赋予其肿瘤主动靶向功能。实验中通过紫外-可见光谱及荧光滴定的方法确定了所合成探针的pH可逆激活特性及其pKa值，结果发现所合成探针具有较理想的pH响应范围，适用于肿瘤细胞特异性成像。此外，该化合物在测试浓度下未表现出明显的细胞毒性，且在细胞水平实现了肿瘤细胞弱酸性微环境的特异性成像。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；UV 3600型紫外-可见-近红外分光光度计(日本，岛津公司)；TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜(德国，莱卡公司)；核磁共振波谱仪(德国，布鲁克公司)；液相色谱-质谱联用仪(美国，赛默飞世尔公司)；PB-10标准型pH计(德国，赛多利斯公司)。

苯肼、三氯氧磷及冰HAc购自国药集团化学试剂有限公司；3-溴丙酸乙酯、3-甲基-2-丁酮及环己酮购自百灵威科技有限公司；氨基葡萄糖盐酸盐、氯乙酰氯、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)购自阿拉丁试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶剂购于天津市康科德科技有限公司；无水SnCl2等其他试剂均为分析纯，购自天津市光复精细化工研究所。实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 实验方法

1.2.1化合物的合成及结构表征化合物的合成路线如图1所示。

图1 化合物的合成路线图Fig.1 Synthetic routes of the compounds

参照我们先前报道的方法合成化合物1～7[12 - 13]。目标化合物的合成：取1.53 g(2.37 mmol)化合物7和氨基葡萄糖盐酸盐0.86 g(3.99 mmol)溶解于25 mL DMF中，加入1.0 mL(5.73 mmol)DIPEA。氮气保护下，室温搅拌5 h。然后将反应液倒入100 mL水中，过滤得暗红色固体。所得粗产品经柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇=10∶1(V/V)，得目标化合物2.75 g，收率为87.30%。

1H NMR (600 MHz,MeOD) δ(ppm)：8.14(1H,d,J=15.6 Hz,-CH=CH-),7.77(1H,d,J=28.8 Hz,-CH=CH-),7.60-7.55(2H,m,ArH),7.45(1H,dd,J1=2.4 Hz,J2=8.4 Hz,ArH),7.19-7.14(2H,m,ArH),6.87(1H,t,J=7.2 Hz,ArH),6.77(1H,d,J=8.4 Hz,ArH),6.56(1H,d,J=15.0 Hz,-CH=CH-),5.59(1H,d,J=10.8 Hz,-CH=CH-),5.32(1H,d,J=3.0 Hz,-NH-),4.05(4H,q,J=7.2 Hz,CH2),3.84～3.80(12H,m,CH2),3.79～3.76(2H,m,CH2),3.54(1H,d,J=16.8 Hz,CH),3.44(1H,t,J=9.6 Hz,CH),3.33～3.32(1H,m,CH),2.66(2H,t,J=6.6 Hz,CH2),2.62～2.58(4H,m,CH2),1.85(2H,t,J=5.4 Hz,CH2),1.60(6H,s,CH3),1.45(6H,s,CH3),1.15(3H,t,J=7.2 Hz,CH3)。

HRMS (ESI+):C43H53ClN4O8,[M+H]+计算值：789.3630,测定值：789.3611。

1.2.2光谱性能及稳定性测定为考察探针溶液在不同pH值下的光学性能，我们选用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)溶液调节待测探针溶液(5.0×10-6mol/L)的pH值(pH=2～9)，用于紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的测试。荧光光谱的测定采用样品的最大吸收波长作为激发波长，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm，扫描范围为795～900 nm。

探针的稳定性通过紫外-可见吸收和荧光光谱确定：取20 mL配好的探针溶液(5.0×10-6mol/L)四份，置于254 nm紫外灯下分别照射0、10 、20及30 min后取出，测定其紫外-可见吸收及荧光光谱(测定荧光光谱前，先用1 mol/L的HCl调节探针溶液的pH值至4左右)。

1.2.3细胞毒性及细胞成像实验选用人乳腺癌细胞(MCF-7)作为研究对象，采用标准的 MTT方法测定目标探针的细胞毒性[7,12]。将处于对数生长期的 MCF-7细胞接种于两块六孔板中(孔板中放有玻璃片)，每个孔的细胞数量在1.0×104～5.0×105之间。培养12 h至细胞贴壁后弃去培养基，加入含有目标探针(1.0×10-5mol/L)的新鲜培养基，继续培养12 h，作为实验组。为验证探针的pH响应特性及肿瘤弱酸性微环境成像的特异性，实验中选取IR783作为对照组，并将含IR783(1.0×10-5mol/L)的培养基加入另一块六孔板中加入继续培养12 h。培养结束后，取出培养液，用0.1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.40)洗涤3次，加入1 mL 4%的多聚甲醛溶液，静置15 min后弃去孔中液体，并用PBS洗涤。随后加入DAPI溶液浸泡5 min，PBS溶液洗涤3次后封片(封片前将孔板底部的玻璃片取出，分被置于pH=7.4及pH=6.0的PBS中洗涤一次)。用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞成像效果。

2 结果与讨论

2.1 目标化合物的设计

我们设计合成了一侧吲哚氮原子上无取代基的不对称菁类化合物(未取代的吲哚氮原子作为pH识别位点)，并在一侧芳环上引入-NH2来调控化合物的pKa，同时作为后修饰位点。为增强化合物的亲水性并赋予其肿瘤靶向性，我们选用氨基葡萄糖对其进一步修饰，合成了氨基葡萄修饰的pH响应型不对称菁类荧光探针。碱性及中性条件下探针以无荧光的碱式体形式存在；而酸性条件下，氮原子被质子化，该化合物由碱式体转变为酸式体形式，并基于分子内电荷转移机理产生较强的荧光，进而实现弱酸性微环境的特异性成像。化合物的两种存在形式如图2所示。

图2 化合物的两种存在形式Fig.2 Two existing forms of the compound

2.2 光谱性质

我们首先考察了介质pH值对所合成探针的光谱性能的影响。目标化合物在不同pH值下的紫外-可见吸收光谱显示(图3(A))，碱性及中性条件下，化合物在520 nm处出现特征吸收峰；随着溶液酸性的逐渐增强，520 nm处吸收峰的强度逐渐减弱，而780 nm处附近出现了新的吸收峰，且其吸收强度逐渐增加；同时在599 nm处出现等吸收点。荧光光谱显示(图3(B))，该探针在碱性及中性环境中无明显荧光；当体系为弱酸性时，化合物的荧光被激活(最大发射波长约为810 nm)，且其荧光强度随体系pH降低而增高，直至pH 接近5.0时其荧光强度达到最大值。更重要的是，将探针溶液由酸性调节至碱性时，可发生上述过程的逆过程。即随环境pH值的改变，该探针可实现荧光的“off-on”可逆转变。

图3 化合物(5.0×10-6 mol/L)在不同pH值下的紫外-可见吸收光谱及荧光光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of the compound (5.0×10-6 mol/L) at different pH value

2.3 pKa的测定

图4 双波长分光光度法确定化合物的pKa的示意图Fig.4 Schematic diagram of the dual-wavelength spectrophotometry for the determination of pKa

为进一步探究该探针是否能被肿瘤细胞弱酸性微环境特异性激活，实现肿瘤特异性成像，我们采用双波长分光光度法测定了所合成探针的pKa值[14]。实验中选取520 nm(碱式体的最大吸收波长)作为第一个工作波长(λ1)，在其酸式体的吸收曲线中选取与520 nm处具有等吸光度的波长(840 nm)作为第二工作波长(λ2)，当化合物全部以碱式体存在时对应λ1、λ2处的吸光度分别为AP1(0.228)和AP2(0.017)(图4)。以log{(Ap1-Ap2)/(A1-A2)-1}为纵坐标，pH为横坐标作图，所得直线与x轴的交点即为所求化合物的pKa值。实验测定化合物的pKa=5.39。该实验结论证实所合成探针具有与肿瘤弱酸性微环境相吻合的pH响应范围。

2.4 稳定性考察

作为一种理想的显影剂，除需具备优异的光学性能外，还需具备良好的光稳定性。比较探针溶液和在波长254 nm紫外灯下照射10、20及30 min后的探针溶液的紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱图可以看出(图略)，探针溶液在此过程中未发生明显的改变，具有较好的稳定性。

2.5 细胞毒性及成像性能研究

图5 不同pH条件下目标探针及对照探针的MCF-7细胞成像Fig.5 MCF-7 cells imaging of the target probe and the control probe under different pH values

上述实验证实所合成的探针具有pH调控的“off-on”可逆荧光特性，且其pH响应范围与肿瘤弱酸性微环境相吻合，有望实现肿瘤特异性成像。因此，我们继续开展该探针在细胞水平的研究。首先将不同浓度的探针(1.0×10-4、5.0×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6及1.0×10-6mol/L)与MCF-7细胞孵育24 h后，考察细胞的相对存活率。结果发现，直到化合物浓度高达1.0×10-5mol/L时，所选细胞的相对存活率仍高于80%，即此浓度下该探针没有明显的细胞毒性，可用于细胞成像研究。进而我们继续探讨了探针的成像特异性。激光共聚焦成像结果表明(图5)，经目标探针孵育后的MCF-7细胞在模拟的正常体液pH值(pH=7.4)下未呈现出荧光信号，而在模拟的肿瘤弱酸性微环境(pH=6.0)下呈现出来明显的荧光信号，且荧光信号均匀的分布在细胞质中。与此相反，与对照探针共培养的MCF-7细胞在pH=7.4及pH=6.0的条件下呈现出来几乎相同的荧光信号。以上实验事实说明目标探针能被内吞进入细胞，且能被弱酸性微环境特异性激活而释放出较强的荧光。换言之，该探针有效的避免的传统“always on”型荧光探针在成像时存在的自身背景信号干扰，能实现肿瘤细胞的特异性成像。