免疫亲和富集-荧光光谱法检测牛血清白蛋白的研究

苏 萍， 陈肖男， 杨 屹

(北京化工大学理学院，北京 100029)

蛋白质是一类重要的生物活性大分子，在基因表达、新陈代谢、免疫反应及物质运输等生命活动中发挥着不可替代的作用，可作为正常生理功能或疾病状态的客观评价指标。蛋白质的分离与纯化是蛋白质组学、临床医学及基因学等研究领域的关键技术[1 - 2]。目前，蛋白质的分离方法主要有固相萃取[3]、双水相萃取[4]、固定化金属离子亲和色谱[5]、分子印迹[6]、电泳[1,7]和免疫亲和富集[8]。免疫亲和富集是一种基于抗原-抗体间特异性反应的分离技术，因其具有特异性好、灵敏度高、分离速度快等优势，在蛋白质分离领域备受青睐。

近年来，多种材料已被报道用作抗体的固定化载体，如硅球[9]、碳纳米管[10]、金纳米粒子[11]和磁性材料[12 - 13]等。在上述材料中，磁性材料具有比表面积大、生物相容性好、磁响应性强、表面易修饰性等优点，已成为研究的热点[14]。目前，免疫磁球(IMMs)已初步应用于复杂生物样品中一些蛋白质的分离与纯化[8]，但其实际应用仍受到局限，因此，发展更有效的IMMs制备方法以及进一步拓展其应用领域具有重要的实际意义。

本文在前期研究[15]工作基础上，通过戊二醛法制备了IMMs。以牛血清白蛋白(BSA)为模板蛋白质，IMMs为吸附剂，建立了免疫亲和富集-荧光光谱法用于目标蛋白质的分离与检测。通过优化免疫亲和富集的实验条件，实现了对人血清样品基质中BSA的选择性分离与检测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

TCS SP5Ⅱ激光共聚扫描电镜(CLSM)(德国，Leica)；Tecnai 20透射电子显微镜(TEM)(荷兰，Philip)；7410振动样品磁强计(VSM)(美国，Lake Shore CryotronicsInc)；F-7000荧光光谱仪(日本,Hitachi)；UltrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS，德国,Bruker Daltonics)。

牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma公司)。戊二醛、氰基硼氢化钠(百灵威科技有限公司)。吐温-20、异硫氰酸荧光素(FITC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。参照文献方法制备BSA多克隆抗体(pAb)(以BSA为免疫原)[16]和氨基化的Fe3O4磁球(MMs)[15]。

1.2 实验方法

1.2.1免疫磁球的制备采用戊二醛法合成IMMs，具体步骤为：于20 mg MMs中加入500 μL戊二醛和4.5 mL 20 mmol/L PBS(pH=8.0)，29 ℃下摇床反应2 h。反应结束后，所得产物用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗涤3次，加入2 mL 2.5 mg/mL抗体溶液和20 mg氰基硼氢化钠，29 ℃下摇床反应5 h。反应结束后，产物用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗涤多次，加入2 mL 2%明胶溶液，29 ℃下摇床反应5 h。产物分散于10 mmol/L PBS(pH=7.4)中，4 ℃保存。

1.2.2荧光标记物的制备用0.5 mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.5)分别配制1 mg/mL的BSA溶液和0.2 mg/mL的FITC溶液。将上述FITC溶液加入BSA溶液中(体积比为1∶20)，边加边震荡，25 ℃下摇床避光反应4 h。反应结束后，反应液在4 ℃下依次于0.5 mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.5)中透析2 d、去离子水中透析1 d。透析结束后，产物FITC-BSA冷冻干燥后,于-20 ℃避光保存。FITC-pAb用类似方法合成，产物溶于10 mmol/L PBS(pH=7.4)中,于4 ℃保存。

1.2.3免疫亲和富集称取100 mg IMMs于离心管中，加入2 mL FITC-BSA溶液或人血清样品溶液，37 ℃下摇床避光反应一定时间后，在磁铁作用下弃去上层清液。用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗涤多次后，加入洗脱剂进行洗脱，洗脱液用荧光光谱法进行分析。

1.2.4荧光光谱分析取1 mL待测样品溶液加入荧光比色皿中进行荧光分析。

2 结果与讨论

2.1 磁性复合材料表征

图1 激光共聚扫描电镜(CLSM)表征：(A)FITC-pAb-MMs的暗场像；(B)FITC-pAb-MMs的明场像；(C)对比实验：在不加入戊二醛的条件下，MMs与FITC-pAb反应后液体的暗场像。TEM表征：(D)Fe3O4；(E)Fe3O4@SiO2；(F)IMMsFig.1 CLSM image:(A) dark field image of the FITC-pAb-MMs;(B) bright field image of the FITC-pAb-MMs;(C) control experiment:the MMs incubated with FITC-pAb conjugates without being modified by glutaraldehyde.TEM image:(D) Fe3O4;(E) Fe3O4@SiO2;(F) IMMsCLSM:The sample concentrations are about 1 mg/mL,and the excitation wavelength is 488 nm.TEM:The sample concentrations are about 0.5 mg/mL,and the voltage is 200 kV.

激光共聚扫描电镜(CLSM)用于验证抗体是否固定于磁球表面。用戊二醛法将FITC-pAb固定于磁球表面，用CLSM进行表征。由图1A、1B可知，荧光是由FITC-pAb-MMs产生的，而不是游离的FITC小分子。由图1C可知，不加入戊二醛时，无荧光现象，表明FITC-pAb与MMs间几乎不存在物理吸附。上述结果表明，抗体在戊二醛作用下成功键合于磁球表面。

透射电镜(TEM)用于直观地观察样品形貌。由图1D～F可知，合成的磁性材料均为单分散的球形结构，Fe3O4磁球表面经过包硅、偶联抗体处理后，粒子尺寸由450 nm增至510 nm左右，进一步表明抗体成功固定于磁球表面。

图2 Fe3O4 (a)、MMs(b)和IMMs(c)的VSM表征图Fig.2 Magnetization curves of Fe3O4 (a),MMs(b) and IMMs(c)

振动样品磁强计(VSM)用于考察样品的磁学性能。由图2可知，三种磁性材料均表现出超顺磁性，随着磁球表面的修饰，其饱和磁化强度由80.06 emu/g下降至40.44 emu/g。上述结果表明，抗体成功固定于磁球表面，合成的IMMs仍具有良好的磁响应性，可在磁场作用下实现快速分离。

2.2 免疫亲和富集条件优化

2.2.1洗脱剂的种类和浓度实验考察了5种不同洗脱剂对富集效果的影响，结果如图3A所示。由图可知，甲醇作为洗脱剂时，回收率最高。因此，选用甲醇作为洗脱剂。实验进一步考察了甲醇浓度对富集效果的影响。由图3B可知，甲醇浓度为80%时，回收率最高。因此，选择80%的甲醇溶液作为最佳的洗脱剂。

2.2.2富集时间实验考察了不同富集时间对富集效果的影响，结果如图3C所示。由图可知，当富集时间达10 min时，回收率达到最大值；富集时间超过10 min后，回收率基本保持不变。因此，选用10 min为最佳的富集时间。

2.2.3洗脱时间实验考察了不同洗脱时间对富集效果的影响，结果如图3D所示。由图可知，当洗脱时间达4 min时，回收率达到最大值；洗脱时间超过4 min后，回收率无明显变化。因此，选用5 min作为最佳的洗脱时间。

图3 (A)洗脱剂种类、(B)甲醇浓度、(C)富集时间和(D)洗脱时间对免疫亲和富集效果的影响Fig.3 Effect of eluant solvent(A),methanol concentration(B),enrichment time(C) and elution time(D) on the performance of the immunoaffinity enrichmentConcentration of FITC-BSA:100 ng/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.(A)Enrichment time:30 min;elution time:10 min.(B) Eluant solvent:methanol;enrichment time:30 min;elution time:10 min.(C) Eluant solvent:80%(V/V) methanol aqueous solution;elution time:10 min.(D) Eluant solvent:80%(V/V) methanol aqueous solution;enrichment time:10 min.

2.2.4等温吸附曲线和标准曲线在上述最佳免疫亲和富集条件下，考察了IMMs对目标蛋白质的饱和吸附容量。100 mg IMMs中加入2 mL不同浓度(0.02～20 μg/mL)的FITC-BSA溶液，免疫亲和富集后用荧光光谱法检测，得到的等温吸附曲线和标准曲线如图4所示。由等温吸附曲线可得，随着FITC-BSA浓度由0.02 μg/mL增加至10 μg/mL，目标蛋白质的吸附量逐渐增加；当FITC-BSA浓度为10 μg/mL时，吸附达到饱和；继续增加FITC-BSA的浓度，目标蛋白质的吸附量几乎不再增加。由此可得，IMMs对目标蛋白质的最大吸附量为107.7 μg/g。由标准曲线可得，当FITC-BSA浓度在0.02～5 μg/mL之间时，目标蛋白质的吸附量与FITC-BSA浓度之间呈线性关系，线性回归方程为y=18.118x+0.9527，相关系数R2=0.9984(n=3，RSD <7%)，检测限为0.02 μg/mL，上述结果表明IMMs适用于后续实验中对目标蛋白质的富集与检测。

2.3 重复使用性

实验考察了制备的IMMs的重复使用情况，结果如图5所示。由图可知，IMMs重复使用10次后，回收率仍保持80%以上。上述结果表明，本实验制备的IMMs具有良好的重复使用性。在免疫亲和富集过程中，IMMs的质量损失和抗体的少量失活引起回收率的略微降低。

图4 FITC-BSA的等温吸附曲线和标准曲线(内图)Fig.4 Adsorption isotherm and calibration curve(inset) of FITC-BSAConcentration of FITC-BSA:0,0.02,0.1,1,3,5,7,10,15,and 20 μg/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.

图5 重复使用次数对免疫亲和富集效果的影响Fig.5 Effect of the number of repeated use on the performance of the immunoaffinity enrichmentConcentration of FITC-BSA:100 ng/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.

2.4 实际样品分析

为了验证该方法在实际复杂样品中应用的可行性和可靠性，实验对人血清样品基质的BSA进行了分离检测。将人血清样品用10 mmol/L PBS(pH=7.4)稀释100倍后，配制浓度为0.4 μg/mL和4 μg/mL的加标样品溶液。称取100 mg IMMs加入上述溶液中，免疫亲和富集目标蛋白质，并用荧光光谱法检测，如表1所示。结果表明，在人血清样品基质中，免疫亲和富集目标蛋白质的加标回收率分别为97.5%和89.3%，IMMs对目标蛋白质的富集效果良好。为了进一步验证该方法的特异性，洗脱后的蛋白质样品用MALDI-TOF-MS测定，结果如图6A所示。质谱图中只在67.6 kDa和33.9 kDa处有峰，与FITC-BSA质谱图(图6B)一致，表明该方法对目标蛋白质具有较强特异性。上述结果表明，该方法可应用于人血清样品基质中目标蛋白质的选择性分离与检测。

表1 免疫亲和富集人血清样品中BSA的回收率

图6 (A)人血清加标样品中FITC-BSA洗脱液和(B)标准FITC-BSA的MALDI-TOF-MS谱图Fig.6 MALDI-TOF-MS spectra of(A) the extrated FITC-BSA from spiked human serum samples and(B) the standard FITC-BSA solution(A) Spiked concentration:4 μg/mL;(B) about 1 mg/mL.

3 结论

本文采用戊二醛法成功制备了具有优良的特异性、分散性和磁响应性的IMMs，将其作为免疫亲和富集吸附剂用于BSA的分离富集，并用荧光光谱法进行检测。通过优化免疫亲和富集的条件，该方法成功应用于人血清基质中BSA的选择性分离与检测。方法具有操作简便、特异性强、选择性好、可重复使用等优点，有望应用于其它复杂生物样品中生物活性大分子的分离与检测。