基于原子力显微镜研究农药对溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响

堵莎莎， 耿秀华， 王 青， 羊小海， 李志平， 郑 艳， 王柯敏

(湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，湖南长沙 410082)

淀粉样变性是细胞内富含β-折叠结构的非水溶性蛋白质纤维的形成和沉积[1]。农药广泛残留于环境中，不仅污染大气、土壤和地下水，还对人体造成急性或慢性损伤[2 - 6]。已有文献报道农药对阿尔兹海默症和帕金森症等淀粉样变性疾病产生重要影响[7 - 14]。例如，Gatto等[12]报道了α-突触核蛋白Rep1多态性与农药之间的相互作用；Franco等[13]研究了百草枯农药作为帕金森神经变性模型诱导神经元细胞死亡的机制；Freire等[14]基于流行病学研究了淀粉样变性疾病帕金森症(PD)和农药暴露之间的关联。然而在分子层面的研究还很少，且对于农药与淀粉样变性关系的研究还不够系统。

本文以溶菌酶为模板蛋白，首先将三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯、三唑酮和西维因四种农药与溶菌酶共孵育，采用原子力显微镜(AFM)成像技术对农药影响下的淀粉样纤维化过程进行形貌表征，之后利用荧光光谱监测农药对淀粉样纤维化过程的影响，最后利用表面等离子体共振(SPR)技术探讨农药与溶菌酶的结合情况。本文从分子水平上研究农药与淀粉样纤维化过程的关系，有望为研究环境因素与淀粉样变性关系奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要试剂

三唑酮、三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯购自上海阿拉丁试剂有限公司；西维因购自北京百灵威科技有限公司；鸡蛋清溶菌酶购自上海生工生物工程有限公司；硫磺素(ThT)购自美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1农药对溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响用已知对实验无影响的丙酮作溶剂将三唑酮、三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯和西维因四种农药溶解成原液，再将农药原液分别加入到含溶菌酶的10 mmol/L HCl溶液(pH=2.0)中。其中溶菌酶的终浓度为20 mg/mL，各种农药的终浓度为农药残留限值最大值(美国环保局食品农药残留限值标准，https://www.epa.gov/pesticides)。在恒温金属振荡浴中1 200 r/min、65 ℃ 的条件下共孵育。每隔0.5 d取一次样品，取出的样品保存于4 ℃冰箱备用。取出的孵育样品溶液用水稀释1 200倍，将10 μL稀释溶液滴在新鲜剥离的云母表面，自然干燥后，用SPI3800-SPA400型扫描探针显微镜(日本,Seiko)进行形貌表征，成像速度为0.85～1.0 Hz，分辨率为512×512。

1.2.2淀粉样纤维化过程的荧光动力学表征淀粉样纤维化过程的荧光动力学是利用荧光染料ThT进行监测的[15]。避光条件下取5 μL孵育样品溶液和295 μL 25 μmol/L ThT溶液置于微孔板中，使用F-7000型荧光光谱仪(日本,Hitachi)进行荧光强度的检测。检测条件为：激发波长为440 nm，发射波长为484 nm，激发光狭缝和发射光狭缝均为5 nm。

1.2.3内源荧光光谱考察农药与溶菌酶的相互作用由于丙酮对蛋白质结构有影响，因此改用对蛋白质结构无影响的乙醇为溶剂配制农药。将三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯、三唑酮和西维因四种农药溶液分别加入到含20 mg/mL溶菌酶的10 mmol/L的HCl溶液(pH=2.0)中，使用荧光光谱仪测定溶菌酶的色氨酸荧光值，测定条件设置为：激发波长为280 nm，激发和发射波长狭缝宽度均为5 nm。

1.2.4表面等离子体技术考察农药与溶菌酶的相互作用采用对实验无影响的丙酮为溶剂配制农药。首先在流通池中通入10 mmol/L HCl溶液(pH=2.0)，利用EC-SPR1010型表面等离子体共振仪(吉林长春鼎诚科技有限公司)记录其SPR光谱；然后加入60 μL 20 mg/mL溶菌酶溶液，孵育30 min后，用10 mmol/L HCl溶液多次冲洗，记录其SPR光谱；分别向流通池中通入四种农药的10 mmol/L HCl溶液，与溶菌酶孵育30 min后，用10 mmol/L HCl溶液多次冲洗，并记录其SPR光谱。

2 结果与讨论

2.1 AFM监测农药对淀粉样纤维化过程的影响

图1 不同农药对溶菌酶淀粉样纤维化过程的AFM图Fig.1 AFM images of lysozyone amyloid fibrosis in the presentce of different pesticides

利用AFM轻敲模式分别表征了三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯、三唑酮和西维因四种农药作用后的淀粉样纤维化样品，如图1所示。单纯溶菌酶随着孵育时间的延长，溶菌酶淀粉样纤维直径逐渐变大，纤维更长，这是由于在淀粉样纤维形成过程中溶菌酶经历了从单体到寡聚体再到原纤维最后成为成熟纤维的演变，与文献结果[16]一致。从整体上可以看出，单纯溶菌酶、与三氯杀螨醇、西维因、三唑酮和氟氯氰菊酯共孵育溶菌酶等的淀粉样纤维化过程基本相似，特别是0、1和5 d的样品，并且淀粉样纤维的直径和长度也相似。然而，孵育2 d后的样品之间形貌表征呈现较大的差异。与单纯溶菌酶2 d形貌表征相比，西维因和三唑酮对淀粉样纤维化过程无明显影响作用，而三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯对淀粉纤维化过程显示促进作用。同时使用仪器自带软件对孵育了1.5 d和2 d后的淀粉样纤维样品进行表面覆盖率的统计，结果如图2所示。对于1.5 d的样品来说，单纯溶菌酶样品的表面覆盖率为4.95%±1.35%。三唑酮和西维因共孵育样品的表面覆盖率依次为4.31%±0.75%和4.13%±0.92%，基本与单纯溶菌酶表面覆盖率持平；而三氯杀螨醇(7.05%±0.69%)和氟氯氰菊酯(8.59%±1.31%)的表面覆盖率明显偏高。同时统计2 d的样品表面覆盖率，结果与1.5 d的相似。由AFM结果可知四种农药中三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯能促进溶菌酶淀粉样纤维的生长，而三唑酮和西维因无明显影响效果。

图2 孵育1.5 d和2 d后淀粉样纤维表面覆盖率的统计图Fig.2 The surface coverage of amyloid fibers after incubation for 1.5 days and 2 days

2.2 农药影响淀粉样纤维化过程的ThT动力学表征

如图3所示，ThT荧光随着时间的延长而逐渐变化，无论农药是否存在，淀粉样纤维化过程均呈“S型”增长。对于单纯溶菌酶而言，淀粉样纤维化过程遵循成核增长机理，S型生长曲线可以分为三个阶段：停滞期、指数增长期(约3 d)和平台期。当分别加入三唑酮和西维因与溶菌酶共孵育后，淀粉样纤维生长曲线与单纯溶菌酶生长曲线基本一致，说明这两种农药对淀粉样纤维生长过程没有明显的影响。当分别加入三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯与溶菌酶共孵育后，可以看出生长曲线发生明显变化：指数增长期缩短至2.5 d，而停滞期和平台期基本保持不变。这与AFM结果一致，说明三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯农药能够促进淀粉样纤维化。

2.3 内源荧光光谱考察农药对溶菌酶的影响

由于蛋白质中的色氨酸残基常作为内源荧光探针来研究溶液状态下的蛋白质构象，因此采用内源荧光光谱法对蛋白质的结构变化进行考察，如图4所示。单纯溶菌酶最大发射波长在343 nm。当加入三唑酮和西维因后，荧光强度与单纯溶菌酶的基本一致，说明这两种农药对溶菌酶基本没有影响。而当加入三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯溶液后，色氨酸残基的荧光强度会下降，说明这两种农药对溶菌酶的构象有影响。

2.4 SPR考察农药对溶菌酶的影响

利用SPR传感技术考察了农药对溶菌酶的影响，结果如图5所示。可以看出，裸金膜SPR光谱为黑色曲线。当加入溶菌酶溶液孵育60 min后，其SPR光谱移动至红色曲线，说明溶菌酶可能通过Au-S键已固定在金膜表面。当分别加入三唑酮和西维因时，几乎没有观察到SPR角度变化(图5a)，说明这两种农药对溶菌酶的影响基本可以忽略。而当分别加入三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯时，SPR角度逐渐变大，共振角度分别增大了0.0147°、0.0115°(图5b)，说明这两种农药对溶菌酶有影响。

图3 四种农药对溶菌酶淀粉样纤维化过程影响的ThT动力学监测Fig.3 Investigation of the effects of four pesticides on lysozyme amyloidosis using ThT measurement

图4 农药存在条件下溶菌酶酪氨酸的内源荧光光谱图Fig.4 Endogenous fluorescence spectra of lysozyme tyrosine in the presence of pesticides

图5 SPR表征四种农药对溶菌酶的影响Fig.5 (a) SPR characterization of the effect of triadimefon and carbaryl on lysozyme;(b) SPR characterization of the effect of dicofol and cyfluthrin on lysozyme

3 结论

本文采用AFM成像技术从分子水平上研究了三氯杀螨醇、氟氯氰菊酯、三唑酮和西维因四种农药对溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响。发现四种农药对溶菌酶淀粉样纤维的形貌特征均没有明显的影响。但是三氯杀螨醇和氟氯氰菊酯缩短了淀粉样纤维生长的指数生长期，对溶菌酶淀粉样纤维化过程有促进作用。本研究工作可为农药对淀粉样纤维化影响过程提供直接证据，并且有望为在分子水平上评价环境因素与淀粉样变性疾病之间的关系提供理论参考。