槲皮素-Al3+-十六烷基三甲基溴化铵体系荧光光度法测定总黄酮

张海容， 梁晓春， 陈金娥

(忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州 034000)

槲皮素(Quercetin)属黄酮醇类化合物，它广泛存在于大自然的植物界，如高良姜、桑寄生、鱼腥草、槐米及银杏叶中[1]。槲皮素具有广泛的生物活性和药理作用，如抗病毒抗肿瘤、抗癌防癌、抗自由基抗氧化、抗抑郁心肌肥厚、抗血小板聚集、降血脂降血压等[2，3]。槲皮素的荧光测定方法主要通过形成金属配合物提高其荧光量子产率、改进分析特性[4 - 6]。相关槲皮素-Al3+体系荧光测定报道比较少见[7，8]。姚本林等[7]用槲皮素-Al3+络合物的荧光测定槐米提取物中槲皮素含量，线性范围2.5×10-6～4.0×10-5mol/L；余琳等[8]在槲皮素-Al3+荧光体系加入胶束Tween-80增敏荧光，线性范围4.0×10-6～1.4×10-4mol/L，检出限2.0× 10-6mol/L，分析特性、灵敏度明显不足。但在槲皮素-Al3+体系中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)荧光增敏法测定槲皮素则未见报道。

本文用荧光法研究了影响槲皮素-Al3+-CTMAB三元体系的各种因素，分析特性显著改善，与已经报道的槲皮素-Al3+荧光体系相比，不仅操作简便，线性范围宽，且有较低的检出限，方法用于银杏叶片中黄酮含量的测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF-5301PC型荧光光度计(日本，岛津公司);AB204-N型电子分析天平(Mettler-Toleclo Group);pHS-3TC型精密数显酸度计(上海天达仪器有限公司)。

无水槲皮素(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)储备溶液：2.0×10-3mol/L;无水AlCl3(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)溶液:2.0×10-3mol/L；十二烷基磺酸钠(SDS，分析纯，中国上海试剂厂)溶液：1.0×10-1mol/L;十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB，分析纯，天津市光复精细化工研究所)溶液：1.0×10-2mol/L;聚氧乙烯月桂醚(Brij-35，Alfa Aesar公司)溶液：1.0×10-5mol/L；β-环糊精(β-CD，生化试剂，北京奥博生物技术责任有限公司)；三酸缓冲溶液按文献方法[9]配制;其余试剂皆为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1试样制备取不同银杏叶片(1#为华钠大药厂生产；2#为涿州东乐制药有限公司生产)各2片，分别用95%乙醇在100 mL的锥形瓶中溶解，并用超声波提取，设定温度为25 ℃，功率为100 W，时间为30 min。最后，转移到100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容。用移液管分别移取样品1#、样品2#上层清液2 mL于100 mL容量瓶中，并用95%乙醇定容，备用。

1.2.2槲皮素测定方法在比色管中依次加入1 mL样品溶液，1 mL Al3+标准溶液，1 mL的CTMAB溶液，2 mL的三酸缓冲液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，室温静置15 min后，测定荧光强度,激发和发射狭缝均为10 nm。

2 结果与讨论

图1 激发和发射的光谱图Fig.1 Excitation and emission spectra cquercetin:2.0×10-5 mol/L; cAl3+:2.0×10-4 mol/L.1.quercetin;2.Al3+;3.quercetin-Al3+;4.quercetin-Al3+-CTMAB.

2.1 槲皮素-Al3+-CTMAB光谱特征

实验分别测定了槲皮素、Al3+、槲皮素-Al3+及其槲皮素-Al3+-CTMAB的荧光光谱，发现槲皮素或Al3+单独存在时两者均无荧光发射；形成槲皮素-Al3+配合物后，在λex/λem=450/539 nm处出现荧光激发和发射峰；当加入一定量CTMAB时，荧光强度显著增大，结果如图1所示。

2.2 不同介质对槲皮素-Al3+荧光强度的影响

实验分别考察了SDS、Brij-35、CTMAB三种不同类型的表面活性剂及β-CD对该体系荧光强度的影响。 实验表明，在酸性条件下，CTMAB对槲皮素-Al3+体系的增敏作用最强，因此本文选择阳离子表面活性剂CTMAB为介质。

2.3 CTMAB浓度对体系荧光强度的影响

在酸性介质(pH=6.10)中，固定槲皮素浓度为2.0×10-5mol/L、Al3+浓度为2.0×10-4mol/L，改变CTMAB浓度并测定体系的荧光强度，结果如图2所示。CTMAB超过1.0×10-3mol/L时的荧光强度不再增大，故选择CTMAB的浓度为1.0×10-3mol/L。

2.4 pH的选择

在pH=2.97～12.10范围内测定槲皮素-Al3+-CTMAB体系的荧光强度。如图3所示，在pH=4.01～7.03范围内荧光强度较强且稳定不变，所以选择pH=6.10的三酸缓冲溶液控制体系的酸度。

图2 CTMAB浓度对荧光强度的影响Fig.2 Effect of CTMAB concentration on fluorescence intensity

图3 pH对荧光强度的影响Fig.3 Effect of pH on fluorescence intensity

图4 Al3+浓度对荧光强度的影响Fig.4 Effect of Al3+concentration on fluorescence intensity

2.5 Al3+浓度的选择

在上述选定最佳条件下，加入不同浓度的Al3+后测定体系的荧光强度。如图4所示，Al3+浓度为2.0×10-4mol/L时荧光强度最大且恒定不变，故选择2.0×10-4mol/L为最佳浓度。

2.6 静置时间的选择

实验研究了静置时间对体系荧光强度的影响。在溶液配制好后每隔10 min测定一次，结果表明，在静置70 min时间范围内荧光强度保持稳定不变，足以完成各种荧光性质测定。

2.7 分析特征

在最佳实验条件下，该体系的荧光强度的对数lgIF与槲皮素浓度的对数lgc呈良好的线性关系，线性范围在4.0×10-8～1.0×10-5mol/L之间,线性回归方程式为:lgIF=0.5744lgc+5.0995,相关系数R2=0.9969,以3σ/K法得到检出限为1.24×10-8mol/L。

2.8 实际样品分析及回收率实验

按实验方法操作，分别测定1#和2#样品中黄酮的含量，结果见表1。同时进行了回收率实验，结果见表2。

表1 样品测定结果

表2 样品回收率的测定结果

3 结论

建立了槲皮素-Al3+-CTMAB荧光体系测定样品总黄酮的新方法。在最佳实验条件下，测定线性范围为4.0×10-8～1.0×10-5mol/L，检出限为1.24×10-8mol/L。