加速溶剂萃取-气相色谱/质谱法测定灯盏花及其土壤中阿特拉津和二甲戊乐灵残留

程启明， 黄 青， 廖祯妮， 杨建文， 吴道聪， 苏 丽

(1.广西大学农学院，广西南宁 530004； 2.中国科学院城市环境研究所，城市环境与健康重点实验室，福建厦门 361021； 3.红河千山生物工程有限公司，云南泸西 652400)

灯盏花(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz)是治疗心脑血管疾病中普遍使用的中草药[1]，因其需求量大，故近年被大量驯化栽培。由于灯盏花生长周期长，田间杂草疯长对灯盏花产量造成了严重影响，故一些除草剂被用以提高产量，其中三嗪类和二硝基苯胺类除草剂[2，3]因效果显著而被大量施用。目前国内关于中草药中农药残留限量的规定还比较少[4]，《中国药典》(2010版)中也仅在甘草、黄芪等少量药材中明确了六六六、滴滴涕等少量农残的限量要求，但欧盟、日本等发达国家对进口中药材制定了严格的最大残留限量标准(MRL)。目前，国内相关农残的报道多集中于蔬菜和水果、食品、牛奶、大豆等[5 - 8]，而灯盏花中除草剂残留未见相关研究报道。

农药残留分析方法通常采用气相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱、液相色谱-质谱联用等方法[7,9 - 11]。样品前处理常采用超声法、均质法和振荡法等[12]，但这些方法存在有机溶剂用量大、耗时长以及农残提取不完全的情况。加速溶剂萃取(ASE)是一种新型的样品提取方法[13]，具有提取效率高、时间短及所用溶剂少等特点，已被美国环保署(EPA)规定为处理固体样品的标准方法之一，但在植物与土壤中的应用研究报道不多见。本研究旨在探讨不同基质样品，以长残效除草剂阿特拉津和易降解除草剂二甲戊乐灵为对象，建立灯盏花中除草剂的残留分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 7890N/5975C气相色谱/质谱联用仪(美国，安捷伦公司)；ASE-350加速溶剂萃取仪(Dionex中国有限公司)；Milli-Q超纯水纯化系统(Milli-Pore公司)；KQ-5200DE数控超声波清洗器(昆山苏美自动化科技有限公司)；FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；Laborata-4000-Efficient旋转蒸发仪(德国，Heidolph公司)；LG-500A高速中药粉碎机(瑞安市百信药机器械厂)。

阿特拉津(Atrazine)标准品(100±0.12 mg/L)和二甲戊乐灵(Pendimethalin)标准品(100±0.13 mg/L)(农业部环境保护科研检测所)，于4 ℃冰箱贮存。根据需要将两种标准溶液稀释成相应的标准工作溶液，用空白基质溶液稀释配制成基质匹配混合标准溶液。分别移取100 mg/L 2种标准品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容，配制成10 mg/L混合标准储备液，-20 ℃保存备用。

乙腈、丙酮、二氯甲烷、正己烷(色谱纯，美国TEDIA公司)；氧化铝(100～200目)、硅藻土、无水硫酸钠、弗罗里硅土(60～100目)(使用前在马弗炉内450 ℃烘4 h，200 ℃时取出置干燥器中冷却备用)、活性炭(分析纯，国药集团)(使用前在烘箱中105 ℃烘烤过夜，取出置干燥器中冷却备用)。

1.2 样品采集

1.2.1样品采集灯盏花及其土壤样品采自云南某灯盏花种植基地。灯盏花(干样)样品采集全草，其土壤距地表0～15 cm，每个地块采集3个平行样本。

1.2.2样品提取将灯盏花植株和风干土粉碎后过20目筛。称取灯盏花或土壤样品2.000 g(0.001 g)、无水硫酸钠10 g、活性炭1 g，混匀后装入11 mL萃取池中(上下层分别填装硅藻土，中间为样品)，使用丙酮-二氯甲烷(1∶1，V/V)混合溶剂，温度60 ℃，压力10.3 MPa，预热5 min，静态萃取10 min，循环2次，清洗萃取池体积60%，吹扫时间120 s，用丙酮-二氯甲烷(1∶1)混合溶剂快速冲洗样品，将提取液转移至250 mL烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，40 ℃水温60 r/min转速旋转蒸发至1 mL左右，转移至层析柱净化。

1.2.3样品净化砂芯玻璃层析柱(25×1.0 cm)自上而下依次装填3 cm无水硫酸钠、7 cm弗罗里硅土、3 cm无水硫酸钠，预先用30 mL正己烷预淋洗柱子，等淋洗液到达上层无水硫酸钠上界面时，关闭层析柱底部开关，弃去淋洗液。将待净化的提取液转入层析柱，用50 mL正己烷∶丙酮(9∶1，V/V)进行洗脱，收集淋出液，置于旋转蒸发仪上蒸发至干，用正己烷溶解至10 mL具塞试管中，用氮吹仪浓缩至1～2 mL，加入少量正己烷，继续氮吹浓缩至少量，重复二次，用正己烷定容至1 mL于色谱条件下进行分析。

1.3 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：氦气，纯度大于99.999%；恒流模式，流速：1.0 mL/min；程序升温：80 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至200 ℃，然后以20 ℃/min升至280 ℃，保持3 min，分析时长11 min，以290 ℃后运行1 min；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样，进样量：1 μL。

质谱条件:离子源温度：230 ℃，接口温度：280 ℃，电离方式：电子轰击电离(EI)，电离能量70 eV，扫描方式：选择离子扫描(SIM)。

2 结果与讨论

2.1 提取与净化方式的选择

2.1.1提取方式的优化研究中对比了二氯甲烷(DCM)、乙腈以及两种混合溶剂正己烷-丙酮(1∶1,V/V)、二氯甲烷-丙酮(1∶1,V/V)。结果表明，乙腈与二氯甲烷-丙酮(1∶1,V/V)提取效率相当，考虑到乙腈毒性相对较大以及便于后续净化处理，选用二氯甲烷-丙酮作为提取溶剂。采用ASE法提取时发现温度高于60 ℃、时间超过10 min，部分农药会发生分解，导致回收率降低；按1.2.2项对加标样品提取后的残渣再次提取并检测，未检出除草剂，表明ASE能有效提取灯盏花及其土壤中的2种除草剂。

2.1.2净化方式的优化基于灯盏花全草成分含有大量的有机酸、酚类、苷类和色素等成分，使得基体具有颜色，故对比了弗罗里硅土(60～100目)和中性氧化铝(100～200目)吸附剂在柱层析的净化差异。结果表明，弗罗里硅土洗脱各种农药残留相对容易，并能有效地吸附灯盏花中的各种色素等杂质，故将弗罗里硅土作为填充柱净化材料之一。此外，2种除草剂用50 mL正己烷/丙酮(9∶1,V/V)能有效洗脱，减少洗脱液则洗脱不完全，加大洗脱液用量回收率虽有微弱上升，但色谱图杂质峰显著增多，基质效应增加。

2.2 线性关系及检出限

分别取一定体积各农药标准储备液混合，用正己烷逐级稀释至系列质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的混合标准工作溶液。为避免基质效应对定量的影响，通过向空白基质中定量添加混合标准溶液的方式，分别配制了灯盏花和土壤的各系列浓度基质匹配混合标准溶液。在选定仪器条件下测定。以质谱定量离子色谱峰面积(Y)对浓度(X,mg/L)绘制标准曲线，线性方程、线性范围及相关系数见表1。2种除草剂的灯盏花及土壤基质匹配混合标准溶液的GC-MS图见图1。结果表明：阿特拉津、二甲戊乐灵2种农药在0.05～2.0 mg/L范围内线性良好，灯盏花基质匹配混合标准溶液的各物质的相关系数在0.9987～1.0000之间；土壤基质匹配混合标准溶液的各物质的相关系数在0.9880～0.9980之间。以信噪比(S/N)为3计算2种除草剂在灯盏花及其土壤中检出限分别为3.00～4.10 ng/g、1.50～2.50 ng/g。

图1 灯盏花(a)及其土壤(b)中2种除草剂的GC-MS色谱图(1.0 μg/mL) Fig.1 The chromatograms of 2 compounds in E.breviscapus(Vant.) Hand-Mazz (a) and soil (b) by GC-MS (1.0 μg/mL) 1.Atrazine;2.Pendimethalin.

CompoundsRetentiontime/(min)Time window/(min)Quantitative and qualifying ions(intensity)RegressionequationLinear rang(mg/L)CorrelationcoefficientAtrazine5.9785.90～6.00200(100),215(59.5)Y=191.06X-817.950.05-2.01.0000Pendimethalin7.2687.20～7.30252(100),281(9.4)Y=158.41X-6730.20.05-2.00.9987

2.3 回收率实验

2种除草剂在灯盏花中的添加水平为0.1、0.5、1.0 mg/L时的平均回收率在67.38%～104.02%之间，相对标准偏差(RSD)为3.21%～13.48%；2种除草剂在土壤中的添加水平为0.1、0.5、1.0 mg/L时的平均回收率在71.69%～105.58%之间，RSD为2.65%～18.26%。

2.4 方法应用

用所建立的方法对采自云南省某灯盏花种植基地使用的两种除草剂的4个灯盏花植株样本，及其4个土壤样本中农药残留情况进行了检测。结果显示，所有灯盏花样品中未检测出阿特拉津，其中两个灯盏花样品(A、C)检测出二甲戊乐灵，浓度分别为51.74±1.68 ng/g、39.11±6.19 ng/g。

4个土壤样品中3个土壤样品(A、B、D)检测出阿特拉津，浓度分别为13.01±1.93 ng/g、35.60±8.95 ng/g、32.94±11.58 ng/g；所有土壤样品(A、B、C、D)中检测出二甲戊乐灵，浓度分别为275.90±38.94 ng/g、38.87±1.53 ng/g、556.87±13.90 ng/g、29.04±3.84 ng/g。

3 结论

本文通过以ASE前处理，弗罗里硅土柱层析净化，以GC-MS-SIM为定性定量分析手段，建立了中草药灯盏花中农药残留的分析方法。研究结果表明：该方法在0.05～2.0 mg/L范围线性关系好，精密度、准确度以及检出限等方面均能够满足农药残留分析的要求，可以为我国中草药及土壤相关农残分析提供参考与借鉴。