乙烯基二茂铁共聚物修饰电极的研究进展

尹应乐， 李 静， 陈新泰， 陆 杰， 刘最芳， 陈绪煌*,

(1.湖北工业大学材料科学与工程学院，湖北武汉 430068； 2.湖北工业大学绿色轻工材料湖北省重点实验室，湖北武汉 430068； 3.空军预警学院黄陂士官学校，湖北武汉 432200)

二茂铁是20世纪50年代发现的一种结构性质特殊、具有重要理论价值和广阔应用前景的茂金属化合物的典型代表。二茂铁衍生物是一类富电子体系物质，此类物质修饰电极的特征是膜中含有氧化还原中心，在电位扫描过程中能发生氧化或还原反应，还能对反应物活化或促进电子的转移速率[1]。小分子电介体易流失增加了电极的不稳定性，限制了其在临床医学方面的应用，而聚合物电介体的出现解决了小分子电介体易流失的缺点，成为近年来研究热点，其中以乙烯基二茂铁(VFc)的研究最为广泛。从VFc的分子结构上来看，VFc为单取代烯类单体可与其他带功能性基团的乙烯基单体共聚合成聚合物电介体[2 - 6]，与小分子电介体相比扩散系数较低，从而减少电介体流失对电极稳定性的影响及其应用的限制；另一方面VFc含有氧化还原中心即二茂铁基团，因而聚合物电介体可以通过“电子跳槽”来进行电子转移，即电子沿着固定在高分子链上的氧化还原中心(二茂铁基团)，经过一系列从还原态的二茂铁基团向氧化态的二茂铁基团跳槽来完成电子的不断传递[7，8]，且VFc的氧化还原电位较低，仅为0.4 V左右[9]。

1 乙烯基二茂铁自由基聚合的特点

VFc的分子结构与苯乙烯有些类似，但VFc苯溶液中自由基聚合并不遵循常规乙烯基单体自由基聚合机理。George[10，11]通过研究由偶氮二异丁腈(AIBN)引发VFc在苯溶液中均聚聚合机理证实了VFc聚合的特异性，其原因是存在“分子内电子转移”，即以VFc基团为端基的增长链自由基容易发生电子由二茂铁基团向自由基转移，从而导致链自由基失活和增长链的提前终止，同时该反应的发生将产生顺磁性Fe(Ⅲ)。乙烯基单体自由基聚合的电子转移终止现象已经被一些学者所证实[12，13]，但不同点是该电子转移反应的发生需要添加金属卤化物，并且此反应属于分子间电子转移反应，因此“分子内电子转移”可用来描述VFc这种新型的终止方式。Tinker等[14]通过研究VFc在1,4-二恶烷中的聚合过程，发现其聚合速率分别与单体浓度的0.97次方和引发剂浓度的0.42次方成正比，基本上与常规乙烯基单体聚合速率关系式相吻合，即该聚合过程遵循常规乙烯基单体的聚合机理，并通过穆斯堡尔谱证实了均聚物中并不存在Fe(Ⅲ)，说明反应过程中不存在“分子内电子转移”。Tinker提出造成VFc在苯和1,4-二恶烷中聚合的显著性差别可能与苯参与“分子内电子转移”有关，一些学者也证实了苯可与VFc之间发生特殊反应[15，16]，而1,4-二恶烷有效避免了该反应的发生，可能与1,4-二恶烷分子中不含共轭π键较为稳定有关。George等[17]通过电子自旋共振波谱发现VFc与丁二烯在1,4-二恶烷中聚合的共聚物中含有Fe(Ⅲ)，说明该聚合过程存在“分子内电子转移”，即该聚合过程并不遵循常规乙烯基单体聚合机理，提出了VFc在1,4-二恶烷溶液中均聚与共聚机理之间的差异可能与溶剂效应和位阻效应有关。随着对VFc聚合的进一步研究，水[18]、1,4-二恶烷与乙醇的混合溶液[19]、乙醇与水的混合溶液[20]也逐渐地作为VFc聚合的溶剂。

2 修饰电极的制备及表征

2.1 修饰电极的制备

分子自组装技术可有效缩短酶活性中心和电极表面间的距离，但对酶的空间取向要求较高，且固定在电极上的酶和聚合物电介体的量有限，底物在电极表面的反应速度缓慢[21]。Hiller等[22]试图将聚合物电介体和葡萄糖氧化酶共同物理吸附于碳电极上，这种方法要求聚合物电介体必须有很长的分子链，既提供足够的吸附链段以防止脱附，又要确保其具有足够的柔性链段，使其能够穿透酶蛋白而抵达酶的活性中心，进而进行电子传递，然而同时满足这两方面十分困难。为防止柔性链聚合物电介体流失，通常需要在电极上采用包埋的方法，如使用半透析膜[23]、导电聚合物膜[24]、碳糊[25]等。溶胶-凝胶制备工艺简单，其多空结构适合固定生物大分子，且物理化学性质如孔径、粘度、成型形状、化学组成、比表面积、导电性等易于控制，加之其优异的光学透过性能为生物传感器的制备提供更多机会和条件[26]。宦迪亮等[27]采用纳米金溶胶与二茂铁构成复合固酶基质，以溶胶-凝胶法固定葡萄糖氧化酶于金溶胶和二茂铁混合制备的碳糊电极表面，增强了葡萄糖氧化酶活性中心与电介体之间的电子转移速率，使传感器的线性范围、寿命和灵敏度显著提高。

2.2 修饰电极的表征

对电活性物质的研究，循环伏安法是一种常用的多功能电化学分析方法，适合于氧化还原反应的表征和机理研究，在电化学生物传感器领域应用较为广泛[28 - 31]。循环伏安法是在固定面积的工作电极和参比电极之间加上对称的三角波扫描电位，记录工作电极上得到的电流与施加电位的关系曲线，即循环伏安图。Senel等[32]采用VFc与甲基丙烯酸缩水甘油酯的共聚物薄膜将过氧化氢酶固定于玻碳电极上来制备一种新型的过氧化氢生物传感器，并通过循环伏安法来进行酶电极电化学性能的表征。研究发现存在过氧化氢时，酶电极氧化峰电流明显高于不存在过氧化氢时的电流，表明催化反应提高了酶电极的氧化电流和辣根过氧化物酶催化过氧化氢发生氧化是以共聚物电介体中的二茂铁基团作为媒介的，即该含乙烯基二茂铁结构单元共聚物电介体可有效地将酶活性中心的电子转移至电极的表面。

3 修饰电极电化学性能的影响因素

3.1 测试电位的影响

含VFc结构单元的聚合物电介体中含有氧化还原中心，在电位扫描的过程中可发生氧化还原反应。Himuro等[9]通过不同测试电位下酶电极循环伏安图的差异来研究测试电位的影响。研究表明电流密度随着葡萄糖浓度的增加而增加，并随检测电位的升高催化电流密度增长速率随之增加，即在高的检测电位下有利于聚合物电介体中的二茂铁基团发生氧化还原反应，从而提高了电极表面与葡萄糖氧化酶活性中心之间电子转移的速率。但尽管如此，过高的检测电位会使一些电活性物质比如尿酸、抗坏血酸等氧化产生电流，这将对葡萄糖检测产生干扰，因此选择合适的检测电位可以提高电化学分析检测的精度。Saito[25]指出当检测电位略高于聚合物电介体的氧化还原电位，酶电极即可电化学催化葡萄糖氧化。

3.2 膜厚度的影响

Himuro等[9]通过调整修饰电极氧化还原聚合物溶液的量来改变聚合物电介体薄膜的厚度，进而研究其对电极电化学性能的影响。研究表明随着氧化还原聚合物薄膜的厚度的增加，氧化和还原峰电流密度都随着增加。其原因为随着氧化还原聚合物薄膜厚度的增加，其中所含的氧化态的二茂铁基团的数量也随之增加，这有利于电子快速地由酶的活性中心转移至电极的表面，从而表现出电流密度的增加。

3.3 测试温度的影响

温度对酶电极电化学性能的影响主要表现为酶活性的高低与所处的温度有关。Cevik等[32]通过检测温度30～50 ℃范围内酶电极的催化电流密度，发现随着温度的升高催化电流也随之升高并在45 ℃下达到最大值，随后逐渐下降，其原因在于辣根过氧化物酶在适宜的温度范围内表现出较高的活性，有利于催化过氧化氢的氧化。Cevik同时还指出在最初的温度区域内催化电流与温度的关系符合阿伦尼斯模型，计算出的活化能Ea为1.67 kJ/mol小于Zhang[33]用聚苯胺固定辣根过氧化物酶案例中的酶活化能，表明辣根过氧化物酶固定在甲基丙烯酸缩水甘油酯与VFc共聚物薄膜上表现出较高的活性。

3.4 乙烯基二茂铁结构单元含量的影响

Saito等[25]制备了不同VFc结构单元含量的VFc与甲基丙烯酸羟基乙酯(HEMA)共聚物，并研究了其对酶电极电化学性能的影响。实验表明随着聚合物电介体中VFc结构单元增加，催化电流密度也随之增加并出现极大值，随后逐渐降低。VFc-HEMA共聚物为两性聚合物，包含有疏水性VFc结构单元和亲水性HEMA结构单元。在低含量VFc结构单元情况下，随着VFc结构单元含量的增加，酶活性中心附近氧化态的二茂铁基团的量也随之增加，从而有利于电子在酶活性中心与电极表面之间的转移，表现出电流密度随之增加，然而随着VFc结构单元的增加，共聚物逐渐由亲水性转变为疏水性，伴随着葡萄糖分子向酶电极扩散的能力随之下降，进而减少了被葡萄糖氧化酶氧化的葡萄糖的数量，与此同时，聚合物链中VFc结构单元含量越高，其链的柔性也就越低，也就降低了其穿透酶蛋白而抵达酶活性中心的能力，因而高VFc结构单元含量的共聚物表现出催化电流密度降低。同时，Saito[34]另一篇论文的观点与该结论相符。

3.5 聚合物电介体中残留单体的影响

聚合物电介体中残留共聚单体将会影响酶电极的稳定性。VFc与其他乙烯基单体(如丙烯酰胺)相比，自由基聚合单体竞聚率较小，随着聚合反应的进行，反应液中残余的丙烯酰胺与VFc之间的比值将逐渐减小，即反应后期反应液中残余的VFc单体含量相对较高，如果反应不充分，反应液中易残留一部分未反应VFc单体。小分子扩散系数相对较大，用未纯化的聚合物电介体修饰电极会造成小分子电介体向检测液扩散。随着聚合物电介体中残余单体的流失，承担酶活性中心与电极表面之间的电子转移的介质由初期的聚合物电介体和残余VFc单体逐渐转变为单独由聚合物电介体来完成二者之间的电子转移，表现出的催化电流密度由高向低直至达到稳定值的转变，从而降低了检测数据的可靠性和重复性，因此合成产物需要对残余的单体进行清除。在去除残余单体的方式上，Kuramoto等[35]采用反复洗涤与沉淀来除去残留的VFc单体,该方法较为简易，但容易造成产物的流失。Liu等[36]则用沉淀和透析的方法来实现残余单体的去除，并用高效液相色谱法检测透析后残留单体的含量，在一定程度上降低了产物的流失。

4 结论

VFc氧化还原电位较低，且呈现出良好的电化学可逆性，因此由VFc合成的聚合物电介体被广泛的用于生物传感器的修饰。VFc自由基聚合过程中容易发生单分子终止反应，即“分子内电子转移”，该反应将使得链自由基失活和聚合物增长链提前终止，从而降低了聚合物分子量，一些学者提出溶剂效应和位阻效应可能是导致该反应发生的主要原因。在酶电极的电化学表征方法中，循环伏安法是较为常用的分析方法。但是，在利用该修饰电极检测分析物浓度之前，需要对检测条件进行优化，以提高修饰电极的灵敏度和稳定性。