16S rRNA在鉴定害肺戴阿里斯特杆菌中的应用

郑丽娜，吕火烊，胡庆丰，张姣丽

(1. 浙江省新华医院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民医院，浙江 杭州 310014；3.嘉兴市第二人民医院，浙江 嘉兴 314012)

·基础与临床研究·

16S rRNA在鉴定害肺戴阿里斯特杆菌中的应用

郑丽娜1,2，吕火烊2@，胡庆丰2，张姣丽3

(1. 浙江省新华医院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民医院，浙江 杭州 310014；3.嘉兴市第二人民医院，浙江 嘉兴 314012)

目的：评估Vitek-2 Compac全自动微生物鉴定系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS )和16S核糖体RNA(16S rRNA)对害肺戴阿里斯特杆菌(Dialister pneumosintes)的鉴定能力。方法分别用Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪、MALDI-TOF MS以及16S rRNA测序对害肺戴阿里斯特杆菌进行鉴定。结果16S rRNA测序鉴定出该致病菌为害肺戴阿里斯特杆菌，而Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪和MALDI-TOF MS均无法鉴定。结论对于害肺戴阿里斯特杆菌，16S rRNA的鉴定方法具有优势。

血培养；害肺戴阿里斯特杆菌；全自动微生物鉴定系统；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；16S核糖体

目前已知戴阿里斯特菌属(Dialister Spp.)有4个菌种，害肺戴阿里斯特杆菌(Dialister pneumosintes,简称Dp)为菌属中的主要菌种[1]，革兰阴性专性厌氧小杆菌。在哥伦比亚血平板上培养形成圆形、透明、表面有光泽、光滑的小菌落。革兰染色，油镜下呈单个，成对或短链分布。害肺戴阿里斯特杆菌是潜在的牙周炎致病菌，是目前临床上牙周组织中较常见的细菌之一，但具体致病机制尚不清楚，再者因为它鉴定比较困难，所以害肺戴阿里斯特杆菌的药敏仍然未知。我们从一例结肠癌患者血培养中分离到该菌，因该致病菌的报道较少，鉴定机制尚不完善，使用常规方法不能及时作出鉴定。为此，本研究以害肺戴阿里斯特杆菌为例，平行对比Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪、MALDI-TOF MS以及以16S rRNA 3种方法的鉴定率，为临床害肺戴阿里斯特杆菌的鉴定提供方法学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2015年9月27日，从浙江省人民医院一例结肠癌患者血培养中分离得到一株害肺戴阿里斯特杆菌。9月27日，患者因高热，体温39.2℃，行双侧双瓶抽取血液进行血培养，血培养2天后于29日凌晨4点右侧厌氧瓶报阳性，随后接种于哥伦比亚血琼脂平板37℃厌氧培养，同时做需氧对照。培养48h，厌氧培养的血平板上培养形成小的、圆形、透明、表面有光泽、光滑的菌落。

1.2 仪器与试剂

BactAlert 3D 240 型自动血培养分析仪，革兰染液，显微镜，Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪购自法国生物梅里埃公司；MALDI-TOFMS 鉴定仪购自德国Bruker公司；MALDI—TOFMS所用试剂如三氟乙酸( TFA )、α-氰-4-羟基苯丙烯酸(HCCA )、色谱纯乙腈、甲酸、无水乙醇购自美国Sigma公司Biometra 公司；T-personal PCR扩增仪购自德国；基因组提取试剂盒购自美国Axygen公司；PCR反应试剂盒、DNA标准带购自日本Takara公司。

1.3 革兰染色及Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定

按常规方法对分离菌株进行革兰染色镜检和Vitek-2 Compac全自动微生物鉴定。

1.4 MALDI-TOF MS鉴定[2]

1.4.1 灭活 挑取2～3个中等大小菌落于1.5ml离心管中，加入300μl蒸馏水混匀，然后加900μl无水乙醇混匀，12000X g离心2min。

1.4.2 提取蛋白 离心后弃去上层乙醇，下层沉淀加入50μl 70%甲酸混匀，然后加入50μl乙腈混匀，12000X g离心2min。

1.4.3 加样 取上清1μl加入德国Bruker公司特制的96孔加样板，待干燥后，加入1μl基质(饱和HCCA溶液)覆盖加样位置。

1.4.4 校准定标 每次实验前需对仪器进行校准定标，以大肠埃希菌DH5α作为标准品。将所取得的特征性质谱峰图与MALDI Biotype 3.0 软件(德

国Bruker 公司)中的数据库进行比较，并用匹配分值来给结果定级。

1.5 16S rRNA测序及比对[3]

1.5.1 细菌DNA提取 从血平板上挑取2～3个中等大小菌落于0.5ml离心管中，加入50μl蒸馏水吹打混匀，煮沸10min，12000 X g离心2min，上清液作为模板DNA。

1.5.2 PCR体系配置 取0.25μl Taq酶，5μl Buffer，4μl dNTP，引物F 1μl，引物R 1μl，模板DNA 2μl，加水至配制成50μl体系。

1.5.3 PCR反应 94℃×5min，94℃×50s→55℃×50s→72℃×50s 30个循环，72℃×5min。

1.5.4 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物在含溴化已锭的1.0%琼脂糖凝胶上100V恒压电泳30min，紫外灯下观察结果，PCR产物经测序后所得DNA序列与GenBank中的数据库进行比对。

2 结果

2.1 革兰染色和Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定

革兰染色为革兰阴性小杆菌，见图1，Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪无法鉴定。

2.2 MALDI-TOF MS鉴定

由于尚未建立未知菌株的数据库，故无法鉴定。

2.3 16S rRNA测序比对结果

分离菌株PCR扩增核苷酸序列长度1532bp，与害肺戴阿里斯特杆菌相似度为100%。(见图2，Query：为分离菌株16S rRNA序列，Sbjct：害肺戴阿里斯特杆菌JCM 10004序列)。

图2 分离菌株16S rRNA序列和害肺戴阿里斯特杆菌JCM 10004序列比较

3 讨 论

Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪具有操作简便、标准化及快速准确等特点，能够对常见致病菌进行鉴定，基本满足疾病预防控制的需要，为细菌检验鉴定提供准确性和有效性。但是对于生长较为缓慢、生化反应模式相近的细菌种类以及少见疑难细菌误鉴概率较高[4]。MALDI-TOF MS能够快速地完成鉴定，成本较低，是目前应用和研究的热点。不足之处在于仪器购置成本较高，大部分的医院没有能力购买，同时技术在细菌药物敏感性试验和细菌耐药性研究方面的能力仍然有限[5]。16S 核糖体RNA(16S ribosomal RNA)[6]是原核生物的核糖体中30S 亚基的组成部分，长度约为1,542 nt，一个细菌的细胞中可包含多种具有不同序列的16S rRNA。 16S rRNA是细菌菌落最常用的基因序列[7]，是获得基因序列研究细菌多样性的克隆扩增，筛选克隆，测序克隆片段最经典的方法。16S rRNA具有高效、准确、简便、特异性强的优点。早在2008年，Bittar F等人就提出了痰液中的复杂生物群，特别是厌氧菌在培养过程中很可能被忽视，他用分子生物学方法检测了多个新兴的病原菌[8]，弥补了细菌培养和表型鉴定的弊端。同时随着基因组学的迅猛发展,细菌16S rRNA间隔区序列数据库不断扩大,序列分析技术对微生物进行分类与鉴定,确定微生物在进化中的位置[9]，已成为微生物分类学中最重要的方法之一。

害肺戴阿里斯特杆菌主要涉及口腔疾病，如牙周炎、急性坏死性溃疡性牙龈炎和根管感染。Colombo AP等人用微生物鉴定基因芯片(homim)发现难治性牙周炎的龈下菌群截然不同于治疗过的牙周炎以及健康的牙周[10]，难治性牙周炎的龈下菌群会持续性地破坏牙周，引起全身感染。害肺戴阿里斯特杆菌也可从呼吸道，包括呼吸机相关性肺炎[11]的感染处分离到。近期研究发现羊水、脑脓肿、肾移植患者的尿标本以及各种临床患者的骨和血培养均可检到。目前文献已报道了2例害肺戴阿里斯特杆菌引起的血源性感染。Kogure M等人报道一位62岁的日本妇女住院时2瓶血培养阳性，经16S rRNA鉴定为害肺戴阿里斯特杆菌，增强CT和磁共振成像确定患者患有鼻窦炎和龋齿[12]。Lee MY等用16S rRNA在另一例全身乏力和发热的菌血症患者血培养中鉴定出害肺戴阿里斯特杆菌和还原天芥菜碱消化链球[13]。可见对本菌的鉴定均有赖于16S rRNA技术。

本例分离到的菌株，在其他方法均无法鉴定的情况下，选用了16S rRNA方法成功进行了鉴定，提示16S rRNA方法可用于害肺戴阿里斯特杆菌的鉴定。为此建议有条件的实验室均应建立多种检测方法，当使用常规鉴定方法和MALDI-TOF MS无法鉴定时可考虑使用16S rRNA方法。

[1]Drago L, Vassena C, Saibene A M, et al. A case of coinfection in a chronic maxillary sinusitis of odontogenic origin: identification of Dialister pneumosintes[J]. J Endod, 2013,39(8):1084-1087.

[2]蔡加昌，张嵘. MALDI-TOF MS在细菌耐药性检测中的应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2013,33(2) :152-155.

[3]Frank J A, Reich C I, Sharma S, et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes[J]. Appl Environ Microbiol,2008,74(8):2461-2470.

[4]黄林，顾迟，唐沪强. VITEK-2 compact系统鉴定临床少见疑难细菌的应用及评价[J]. 检验医学,2014,29(11):1175-1177.

[5]程敬伟，孙林英，徐志鹏，等. Vitek-2 Compact和MALDI TOF MS对棒状杆菌属细菌鉴定能力评估[J]. 现代检验医学杂志,2014,29(9):15-17.

[6]Witek M A, Conn G L. Functional dichotomy in the 16S rRNA (m1A1408) methyltransferase family and control of catalytic activity via a novel tryptophan mediated loop reorganization[J]. Nucleic Acids Res, 2016,44(1):342-353.

[7]Beernink T M, Wever P C, Hermans M H, et al. Capnocytophaga canimorsus meningitis diagnosed by 16S rRNA PCR[J].Practical?neurology.?2015:practneurol-2015-001166.

[8]Bittar F, Richet H, Dubus J C, et al. Molecular detection of multiple emerging pathogens in sputa from cystic fibrosis patients[J]. PLoS One,2008,3(8):e2908.

[9]Sanschagrin S, Yergeau E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons[J]. J Vis Exp,2014(90) :e51709.

[10]Colombo A P, Boches S K, Cotton S L, et al. Comparisons of subgingival microbial profiles of refractory periodontitis, severe periodontitis, and periodontal health using the human oral microbe identification microarray[J]. J Periodontol,2009,80(9):1421-1432.

[11]Bahrani-Mougeot F K, Paster B J, Coleman S, et al. Molecular analysis of oral and respiratory bacterial species associated with ventilator-associated pneumonia[J]. J Clin Microbiol,2007,45(5):1588-1593.

[12]Kogure M, Suzuki H, Ishiguro S, et al. Dialister pneumosintes bacteremia caused by dental caries and sinusitis[J]. Intern Med,2015,54(6):663-667.

[13]Lee M Y, Kim Y J, Gu H J, et al. A Case of Bacteremia Caused by Dialister pneumosintes and Slackia exigua in a Patient with Periapical Abscess[J]. Anaerobe, 2016,38:36-38.

Theapplicationof16SrRNAinidentificationofdialisterpneumosintes

ZHENGLina1,2，LVHuoyang2@，HUQingfeng2，ZHANGJiaoli3

(1.Zhejiang Xinhua Hospital ,Hangzhou 310005,China;2.Zhejiang Province People's Hospital, Hangzhou 310014,China; 3. The Second People's Hospital of Jiaxing, Zhejiang 314012, China)

ObjectiveTo evaluate thedifferent identification of dialisterpneumosintes.MethodVitek-2 Compact, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)and 16S ribosomal RNA (16S rRNA) were respectively used to identifydialisterpneumosintes.Result16S rRNA can identificatedialisterpneumosintes and Vitek-2 Compact and MALDI-TOF MS can not.ConclutionForDialister pneumosintes, the identification method of 16S rRNAhas more advantage than the others.

Blood culture；Dialister pneumosintes；Vitek-2 Compact；MALDI-TOF MS；16S rRNA；

郑丽娜(1988-)，女，浙江杭州人，本科，初级检验技师。研究方向：临床微生物学检验

@

吕火烊 lab_lhx@126.com

R37

B

1672-0024(2016)03-0041-04