骨髓间充质干细胞在重症急性胰腺炎大鼠胰腺中的分化研究

单毓强，罗 亮，金慧成@，吴 懿，蔡 阳，贾 忠，封光华

(1.杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006；2. 广州中山大学附属第一医院，广州 510080)

·基础与临床研究·

骨髓间充质干细胞在重症急性胰腺炎大鼠胰腺中的分化研究

单毓强1，罗 亮2，金慧成1@，吴 懿1，蔡 阳1，贾 忠1，封光华1

(1.杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006；2. 广州中山大学附属第一医院，广州 510080)

目的：探讨重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)大鼠胰腺中骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells， MSCs)向内皮细胞分化的实验研究。方法将40只大鼠随机分为正常组、SAP组、MSC组、MSC加粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)组。检测MSC向内皮细胞分化的转化率、血清白介素IL-10的浓度以及淀粉酶的含量。结果骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的转化率上升，血清白介素IL-10的浓度升高，血清淀粉酶的含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结论重症急性胰腺炎大鼠骨髓间充质干细胞可向内皮细胞进行分化，修复胰腺损伤。加入粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，可提高MSC向内皮细胞分化的转化率。

重症急性胰腺炎；骨髓间充质干细胞；内皮细胞

Abstract：[Objective] To investigate the bone marrow mesenchymal stem cells(MSC)converting to the endothelial cells for the severe acute pancreatitis(SAP)in rats. [Method] A total of forty rats were randomly separated to the SAP group(n=10), the normal group(n=10), the bone marrow MSC group(n=10), the bone marrow MSC and the granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)group(n=10). The conversion rates of the bone marrow mesenchymal stem cells, the expression of the interleukin-10(IL-10)and the contents of the amylases in serum were detected. [Result] The conversion rates of the bone marrow MSCs and the concentration of interleukin-10 in serum increased, furthermore, the contents of the amylases reduced. There were statistically differences(P<0.05). [Conclusion] The bone marrow MSCs can be significantly transformed into the endothelial cells in the progress of the severe acute pancreatitis. When adding the granulocyte colony-stimulating factor, the rates of conversion are strengthened than before.

Keywords: severe acute pancreatitis; mesenchymal stem cells; endothelial cells

本实验通过研究在重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)损伤的胰腺内，骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)分化为内皮细胞的转化率，深入探讨MSC治疗SAP的干细胞移植新方法。骨髓MSCs有多向分化潜能，在胰腺损伤时发挥再生和修复作用[1]。粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)属于细胞生长因子，可以起到改善损伤胰腺微循环的作用[2]。据文献报道，MSC可用于治疗肝损伤[3]、肺损伤[4]，但是MSC治疗胰腺损伤的相关报道较少。本实验采用SAP大鼠注射EDU标记的MSC和G-CSF[5]，检测MSC向内皮细胞分化的转化率、血清白介素IL-10的浓度以及淀粉酶的含量。研究在胰腺损伤时，MSC分化为内皮细胞的内在机制，有助于在制定SAP临床治疗方案时，发展新的干细胞替代治疗方法，具有广阔的临床应用前景。

1 资料与方法

1.1 动物与试剂

年龄一致、状态健康的雄性成年大鼠，体重200～250g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证：0096502；幼鼠，体重40～50g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证：0097319；L-精氨酸购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；重组人粒细胞刺激因子注射液购于齐鲁制药有限公司；IL-10 ELISA试剂盒购于Neo Bioscience公司；淀粉酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 培养MSC与标记EDU

在造模前7天时，把幼鼠脱臼处死后，使用75%酒精进行浸泡。在无菌的条件下，分离股骨，使用DMEM培养基把骨髓冲出，制成骨髓的单细胞悬液。取培养3代后的MSC调整细胞浓度为1×106个/ml。EDU标记过程，采用4%多聚甲醛进行固定，含0.5%Trion X-100的PBS中室温进行孵育，再加入1×Apollo工作液避光孵育，采用DAPI染核后，荧光淬灭剂封片，荧光显微镜拍照。

1.3 动物分组及造模

将40只成年大鼠，随机分为4组，每组10只。正常组，常规饲养。SAP组，2次腹腔注射2g/kg 的L-精氨酸，间隔1h；造模成功12h后，经尾静脉注射PBS饲养。MSC组，造模成功12h后，经尾静脉注射1×106个/ml培养3代的MSC。MSC与G-CSF组，造模成功12h后，经尾静脉注射1×106个/ml培养3代的MSC；再在12h、24h、36h，分别经尾静脉注射40μg/kg的G-CSF。分组造模成功后，分别在第3天、第7天随机处死每组5只大鼠，进行解剖取胰腺组织并眼球取血。免疫荧光法检测胰腺组织MSC的干细胞转化率，ELISA法检测血清白介素IL-10的浓度，生化法检测淀粉酶的含量。

1.4 检测干细胞转化率

分别在第3天、第7天随机处死每组5只大鼠，进行解剖取胰腺组织。将大鼠胰腺用4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、染色，观察胰腺组织的病理学改变。使用二甲苯脱蜡，依次经过100%、95%、85%、75%、50%乙醇，水。进行抗原修复的过程，使用10%正常山羊血清封闭，一抗4℃孵育过夜。分别用荧光标记二抗湿盒和DAPI湿盒，进行室温避光孵育。抗荧光淬灭剂封片后，使用荧光显微镜观察。免疫荧光法检测血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)，vWF是内皮细胞的重要标志物，vWF和EDU双标记细胞结果可用于分析MSC分化为内皮细胞的干细胞转化率，从而探讨MSC修复SAP大鼠胰腺组织的机制。

1.5 检测血清白介素IL-10浓度

反应孔加入标本和不同浓度的标准品，空白孔加入标准品通用稀释液。再向反应孔加入生物素化抗体工作液，空白孔加入生物素化抗体稀释液。避光室温放置后，反应孔加入酶结合物工作液，空白孔加入酶结合物稀释液。使用酶标仪检测白介素IL-10的OD450值，并根据标准曲线的公式计算白介素IL-10的浓度。

1.6 检测血清淀粉酶含量

分别在第3天、第7天随机处死每组5只大鼠，眼球取血，全血离心并分离血清，用于检测血清淀粉酶含量。

1.7 统计学处理

采用SPSS13.0软件完成统计处理，实验数据以平均数±标准差表示。组间和组内比较采用多重样本独立非参数检验和重复测量方差分析，P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 培养MSC与标记EDU

原代培养的骨髓间充质干细胞主要有成纤维样细胞、巨噬细胞和圆形内皮样细胞。传代培养后，可除去其他成份的细胞，使细胞成份逐渐纯化。MSC分离培养初期，少量的贴壁细胞聚集生长。传代培养后，细胞大量增殖，多数呈成纤维细胞样形态。细胞传3代后，细胞形态均一，大多呈涡旋状排列的细胞集落。红色表示EDU标记的核。

2.2 大鼠生长情况

正常组大鼠状态尚可。手术组大鼠状态欠佳，少量进食，并排有黑便；注射处出现瘀黑，有毛发脱落。第3天处死每组5只大鼠，第7天处死每组剩余5只大鼠，解剖取胰腺组织并眼球取血。正常组大鼠无腹水，胰腺呈粉红色，脏器无水肿坏死。SAP组大鼠有大量腹水，颜色晦暗，胰腺明显充血、水肿、坏死，脏器粘连、肿胀、坏死。MSC组、MSC与G-CSF组大鼠有少量腹水，胰腺轻微充血水肿，脏器少见粘连坏死。

2.3 干细胞转化率的检测

荧光显微镜可见，SAP组大鼠胰腺结构不清，有明显的炎性细胞浸润。MSC组大鼠胰腺结构部分再建，可见小循环系统的管腔组织。免疫荧光检测可知， MSC组vWF和EDU双标记细胞荧光计数平均每视野第3天为6个，第7天为7个；MSC与G-CSF组的vWF和EDU双标记细胞荧光计数平均每视野第3天为8个，第7天为12个；观察数据服从泊松分布。MSC组vWF和EDU双标记细胞荧光计数均低于MSC与G-CSF组。实验结果表明，MSC能修复SAP产生的胰腺损伤。加入粒细胞集落刺激因子后，发挥协同作用，能提高MSC分化为内皮细胞的转化率，增强MSC的修复作用。

2.4 血清淀粉酶含量的检测

淀粉酶结果可知，正常组的淀粉酶含量低于SAP组(P=0.044)，MSC组的淀粉酶含量也低于SAP组(P=0.029)。MSC组的淀粉酶含量高于MSC与G-CSF组(P=0.045)。通过重复测量方差分析，组间差异有统计学意义。第3天到第7天，血清淀粉酶的含量逐渐下降，组内差异无统计学意义(表1)。实验结果表明，加入MSC进行治疗后，炎症反应有所减轻，MSC可减轻SAP的炎症反应。加入G-CSF后，增加了抑制炎症反应的作用，增强了MSC的再生和修复作用。

2.5 血清白介素IL-10浓度的检测

白介素IL-10结果可知，正常组的IL-10浓度高于SAP组(P=0.034)，MSC组的IL-10浓度也高于SAP组(P=0.028)。MSC与G-CSF组的IL-10浓度高于MSC组(P=0.041)。通过重复测量方差分析，组间差异有统计学意义。第3天到第7天，血清白介素IL-10的浓度逐渐上升，组内差异无统计学意义(表1)。实验结果表明，加入MSC进行治疗后，保护性因子IL-10增多，导致炎性介质减少，SAP导致的胰腺损伤逐步缓解，MSC修复胰腺的作用增强。加入G-CSF进行治疗后，G-CSF的促进血管生成的作用，改善了胰腺的微循环，使修复作用得以加强(表1)。

3 讨 论

有研究者认为，在干细胞迁移因子和干细胞特异性生长因子的作用下[6]， MSC可迁移至SAP损伤的胰腺，分化为内皮细胞，再生和修复组织损伤。因此本实验应用MSC治疗SAP产生的急性重度胰腺损伤，通过观察胰腺中MSC转化成内皮细胞的情况，研究MSC治疗SAP的内在机制。MSC分化为内皮细胞的转化率升高时， IL-10在免疫调节方面起保护性作用[7]。同时，在SAP导致胰腺损伤后，血清淀粉酶的含量增多。因此，在研究MSC分化为内皮细胞治疗胰腺损伤时，我们选择IL-10和血清淀粉酶作为关键检测指标。从3天到7天的实验观察期内，MSC分化为内皮细胞的转化率上升，血清白介素IL-10的浓度升高，血清淀粉酶的含量降低。说明SAP导致的胰腺急性炎症得到控制，严重的临床症状有所缓解。本实验结果充分验证了SAP由急性炎症状态到炎症缓解状态相关指标的改变，以及胰腺再生修复的过程。另外，加入G-CSF与MSC联合进行SAP治疗，内皮细胞转化率、IL-10水平上升，淀粉酶水平下降，可见在应用MSC修复胰腺损伤的同时，加入G-CSF，能起到协同作用，更加有利于胰腺的损伤修复[8]。本实验在探讨重症急性胰腺炎大鼠胰腺，骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的内在机制方面，为重症急性胰腺炎的临床治疗，提供了新思路、新方法[9]。应用骨髓间充质干细胞的干细胞替代疗法，有着广阔的临床应用价值。

[1]常颖,齐欣,卜丽莎，等.成人骨髓问充质干细胞体外多向分化潜能特性的研究[J].中国危重病急救医学,2005,17:95-97.

[2]施亚斌,李香业,陆岳林，等.肿瘤化疗前应用重组人粒细胞集落刺激因子预防白细胞减少临床研究[J].医学研究杂志,2007,36:55-57.

[3]段峰,王茂强,高春记.介入微创式门静脉内间充质干细胞移植治疗肝硬化可行性的实验研究[J].生物医学工程与临床,2008,12:355-359.

[4]高婧,蔡曦光,刘华.骨髓间充质干细胞移植对百草枯所致急性肺损伤治疗的研究[J].国际呼吸杂志,2011,31:270-274.

[5]江学良,李兆申,崔慧斐.骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用[J].世界华人消化杂志,2006,14:398-404.

[6]郭军一,林国生,鲍翠玉.干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响[J].中国医师杂志,2004,6:1601-1604.

[7]张喜平,陈轶欣,章丽芳.急性胰腺炎与细胞因子[J].医学研究杂志,2007,36:74-77.

[8]赵玉.2005年普通外科进展回顾与展望[J].中华外科杂志,2006,44:434-440.

[9]邢同京,徐洪涛.骨髓干细胞动员在肝衰竭治疗中的应用及其机制研究进展[J].中华临床感染病杂志,2009,2:378-381.

Experimentalstudyonconvertingthebonemarrowmesenchymalstemcellstotheendothelialcellsforthesevereacutepancreatitisinrats

SHANYuqiang1,LUOLiang2,JINHuicheng1@,WUYi1,CAIYang1,JIAZhong1,FENGGuanghua1

(1.The First People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310006, China; 2.The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University , Guangzhou 510080, China)

单毓强(1975-)，男，浙江东阳人，硕士，副主任医师。研究方向：干细胞移植、胃肠肿瘤基础与临床研究

金慧成 shang110117@163.com

R331.2

A

1672-0024(2013)06-0039-04

@