ZPI基因外显子-3多态性与妊娠高血压疾病子痫前期凝血功能的相关性分析

马雅英，黄斌伦，王 敏，徐秋仙，程 屹，何云芹

(1.平湖市第一人民医院，浙江 平湖 314200；2.金华职业技术学院医学院， 浙江 金华 321017；3.金华市中心医院， 浙江 金华 321000)

·基础与临床研究·

ZPI基因外显子-3多态性与妊娠高血压疾病子痫前期凝血功能的相关性分析

马雅英1，黄斌伦2@，王 敏2，徐秋仙3，程 屹3，何云芹3

(1.平湖市第一人民医院，浙江 平湖 314200；2.金华职业技术学院医学院， 浙江 金华 321017；3.金华市中心医院， 浙江 金华 321000)

目的：探讨蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂(ZPI)基因外显子-3(exon-3)多态性是否影响妊娠高血压疾病子痫前期患者的凝血功能。方法选择无血缘关系的健康孕妇40例、妊娠期高血压疾病子痫前期患者48例，用凝固法测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原含量(Fg)。用直接DNA测序法对ZPI基因exon-3测序分析。结果ZPI 基因外显子-3在exon-3 137A>G(K46R)、181A>G(S61G)、481A>T(T161S)存在基因多态性；健康孕妇与妊娠高血压子痫前期比较，无论哪种基因突变，其不同基因型之间PT、APTT、TT和Fg结果差异均无统计学意义(P均>0.05)。exon-3的181位基因多态性和exon-3的481位基因多态性密切相关，即181位基因型为AA型的个体在481位基因上均为AA型，181位基因型为AG型的个体在481位基因上均为AT型，181位基因型为GG型的个体在481位基因上均为TT型。结论ZPI基因exon-3 137A>G、181A>G、481A>T多态性并不影响妊娠期高血压疾病子痫前期患者凝血功能，且181A>G基因多态性变化与481A>T基因多态性有相关性。

蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂；基因多态性；子痫前期，妊娠高血压疾病；凝血功能

Abstract：[Objective]To explore the relationship of the exon-3 polymorphism of protein Z-dependent protease inhibitor (ZPI) gene and the coagulation function of the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. [Method] The blood samples were collected from 40 unrelated healthy pregnant women and 48 with the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. The prothrombin time (PT), international normalization ratio (INR), activated partial thromboplastin time (APTT) , thrombin time (TT)and fibrinogen (Fg) were measured with solidified method. The exon-3 DNA sequence of ZPI was detected by direct DNA sequencing. [Result] ZPI exon-3 contains three mutations 137A>G(K46R)、181A>G(S61G)and 481A>T(T161S). However, when comparing healthy pregnant women with the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy, we found that there were no statistical significance between any of them in PT, APTT, TT, and Fg (P>0.05). 181 gene polymorphism in Exon 3 and 481 gene polymorphism in Exon 3 are closely related, with 181 genotype AA, AG and GG being respectively AA,AT and TT in the 481. [Conclusion] ZPI gene polymorphisms of exon-3 137A>G、181A>G、481A>T do not affect the blood coagulation function of the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. The genotype of the 181 gene polymorphism in Exon 3 and 481 gene polymorphism in Exon 3 are closely related.

Keywords: protein Z-dependent protease inhibitor；gene ploymorphisms；preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy ；blood coagulation function

蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂(Protein Z-dependent Protease Inhibitor，ZPI)是一种体内重要的抗凝调节蛋白，在Ca2+、磷脂存在的条件下，与蛋白Z(Protein Z，PZ)、凝血因子Ⅹa结合，形成Ca2+-ZPI-PZ-Ⅹa复合物，抑制Ⅹa活性；另外，ZPI还能直接抑制Ⅺa活性，从多个方面起到抗凝作用，降低机体血栓形成风险。作者在研究ZPI对妊娠期高血压疾病高凝状态是否有影响时，发现ZPI基因外显子-3(exon-3)存在基因多态性。因此，通过对妊娠期高血压疾病子痫前期患者和健康妊娠妇女ZPI基因exon-3测序对照分析，探讨ZPI基因多态性是否影响妊娠高血压疾病子痫前期患者的凝血功能。

1 材料和方法

1.1 对象

根据妊娠高血压疾病诊断和分类标准[1]，收集2010年1月至2011年12月妊娠期高血压疾病子痫前期患者48例(下称子痫前期组)，其中轻度子痫前期11例，年龄20～35岁(平均25.5±6.7岁)，孕期37～39周(平均37.5±0.5周)；重度子痫前期37例，年龄22～36岁(平均27.9±3.5岁)，孕期30～39周(平均34.6±2.6周)；同时，收集健康孕妇40例(下称对照组)，年龄20～38岁(平均27.3±5.8岁)，孕期22～40周(平均29.3±10.2周)。所有研究对象均来自浙江地区汉族人群无血缘关系。各组均无肝脏疾病、高血压、糖尿病、血栓病史、肿瘤等病史，也未使用影响凝血功能的药物。所有受试对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理 空腹抽静脉血，用0.109mol/L枸橼酸钠按1:9抗凝，制备泛血小板血浆和全血细胞，部分血浆在2小时内用凝固法测定凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)，具体参见文献[2]，另一部分血浆和血细胞保存于-80℃超低温冰箱中，血细胞用于基因测序。

1.2.2 ZPI exon-3测序 用Primer5软件设计ZPI外显子-3的引物，上游引物序列为：5'GGGCAGGGCTAACCTACTT3'，下游引物序列为: 5'GCGTCTGGCACTGTTCAATA3'。DNA提取采用生工SK8224试剂盒。用PCR反应扩增仪(加拿大 BBI公司)对ZPI外显子-3的进行扩增；PCR反应条件：95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，58℃退火35秒，72℃延伸50秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。扩增产物在电压150V、电流10mA下，1%琼脂糖凝胶电泳20分钟。PCR产物用纯化回收试剂盒(生工SK1141)回收并纯化。用3730XL测序仪(美国 ABI 公司)进行测序。有关基因测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成。

2 结果

2.1 ZPI 基因测序结果

通过对对照组和子痫前期组ZPI exon-3测序分析，结果发现在exon-3 137A>G(密码子AAG→AGG，赖氨酸→精氨酸即K46R)、181A>G(密码子AGT→GGA，丝氨酸→甘氨酸即S61G)、481A>T(密码子ACT→TCT，苏氨酸→丝氨酸即T161S)存在基因多态性。

2.2 不同ZPI exon-3多态性基因的凝血指标测定结果

2.2.1 ZPI exon-3 137A>G基因多态性凝血指标测定结果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4项凝血指标，在AA型基因组中，对照组(N=6)和子痫前期组(N=12)分别为11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.58±1.23、30.85±2.22、16.48±1.16、3.160±0.32；GG型基因组中，对照组(N=18)和子痫前期组(N=16)分别为11.11±1.25、30.49±2.86、15.76±0.93、3.06±0.43和11.60±1.07、31.97±2.25、15.31±0.85、3.10±0.40；AG型基因组中，对照组(N=16)和子痫前期组(N=20)分别为11.50±1.10、30.90±2.12、15.66±1.14、3.15±0.67和11.46±0.81、31.02±1.72、16.14±0.74、3.27.±0.27。经统计学分析，对照组与子痫前期组在不同基因型之间，4种凝血指标差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2.2 ZPI exon-3 181A>G基因多态性凝血指标测定结果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 四项凝血指标，在AA型基因组，对照组(N=6)和子痫前期组(N=14)分别为11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.57±1.13、32.23±2.26、16.31±1.15、3.27±0.43；GG型组中，对照组(N=14)和子痫前期组(N=12)分别为11.34±1.33、30.11±3.13、16.00±0.85、2.89±0.25和11.47±0.79、31.80±2.56、15.57±0.83、2.93±0.26；在AG型组中，对照组(N=20)和子痫前期组(N=22)分别为11.26±1.10、31.09±1.97、15.51±1.09、3.25±0.65和11.56±1.04、31.06±1.64、15.93±0.94、3.24±0.42。经统计学分析，对照组与子痫前期组在不同基因型之间，4种凝血指标差异也均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2.3 ZPI exon-3 481A>T基因多态性凝血指标测定结果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4项凝血指标，在AA型基因组中，对照组(N=6)和子痫前期组(N=14)分别为11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.57±1.13、32.23±2.26、16.31±1.15、3.27±0.43；TT型基因组中，对照组(N=14)和子痫前期组(N=12)分别为11.34±1.33、30.11±3.13、16.00±0.85、2.89±0.25和11.47±0.79、31.80±2.56、15.57±0.83、2.93±0.26；AT型基因组中，对照组(N=20)和子痫前期组(N=22)分别为11.26±1.10、31.09±1.97、15.51±1.09、3.25±0.65和11.56±1.04、31.06±1.64、15.93±0.94、3.24±0.42。经统计学分析，对照组与子痫前期组在不同基因型之间，4种凝血指标差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2.4 对照组内和子痫前期组内，对ZPI exon-3 137位各基因型之间凝血指标分别进行比较。对照组内PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4项凝血指标，AA型(N=6)分别为11.6±1.1、32.3±3.4、16.2±0.8、2.96±0.44，AG型(N=16)分别为11.5±1.1、30.9±2.1、15.7±1.1、3.15±0.67，GG型(N=18)分别为11.1±1.3、30.5±2.9、15.8±0.9、3.06±0.43，经统计学分析，对照组组内不同基因型之间，各种凝血指标差异均无统计学意义(P均>0.05)。子痫前期组内PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4项凝血指标，AA型(N=12)分别为11.6±1.2、30.85±2.2、16.5±1.2、3.16±0.32，AG型(N=20)分别为11.5±0.8、31.02±1.7、16.1±0.7、3.24±0.46，GG型(N=16)分别为11.6±1.1、31.98±2.25、15.3±0.85、3.10±0.40，经统计学分析，子痫前期组组内不同基因型之间，各种凝血指标差异也均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 3种ZPI基因多态性之间的相关性分析

以ZPI exon-3 181位基因多态性作为对照组，观察与其它2种基因多态性的相关性，结果见表1。发现exon-3的181位基因多态性和exon-3 的481位基因多态性密切相关，即181位基因型为AA型的个体在481位基因上均为AA型，181位基因型为AG型在481位基因上均为AT型，181位基因型为GG型的在481位基因上均为TT型；另外，与exon-3 的137位基因也密切相关(采用Pearson列联系数来表示，C=0.777，P<0.001)。

表1 3种ZPI基因exon-3多态性相关性分析

2.4 ZPI基因外显子-3多态性对照组和子痫前期组之间的表达情况

ZPI基因外显子-3多态性的3个位点不同基因型在对照组和子痫前期组之间表达情况进行比较，结果见表2。经Pearson卡方检验，结果表明2组之间各种基因型表达差异无统计学意义(P均>0.05)。

表2 对照组和子痫前期组ZPI exon-3中3个位点不同基因型表达的比较

3 讨论

PT是外源性凝血系统较为敏感的常用筛选实验,反映血浆中凝血因子Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ 、Ⅹ水平；APTT是内源性凝血系统较为敏感的常用筛选实验,反映血浆凝血因子Ⅷ 、Ⅸ、Ⅹ 、Ⅺ水平；TT主要反映血液中Fg含量和肝素类等抗凝物质是否增多；Fg是血浆黏滞度高低的主要影响因素，在血小板聚集和血栓形成过程中起着重要作用,其含量增高促进血栓形成。以上指标能较好地反映体内凝血状态情况。

ZPI基因多态性与其抗凝活性是否相关，各家报道不一。Laura K等报道[3]ZPI两个位点错义突变F145L和Q384R后，从体外研究表明ZPI抑制FXa活性的能力下降，其中Q384R突变后抑制FXa作用减少68%，F145L突变后抑制FXIa作用减少2%～3%，认为这两个位点突变降低了ZPI抗凝活性，增加血栓形成的风险。Ndonwi M等报道[4]，ZPI基因多态性K25R、S40G的蛋白质活性与各自的野生型蛋白质活性相似，并经细胞转染研究表明，这些多态性不影响蛋白的表达和分泌，说明这两个位点的基因多态性不影响蛋白质的功能。本研究中ZPI基因存在K46R、S61G、T161S的3种突变，从实验结果看，妊娠高血压子痫前期组与对照组比较，各种基因型之间的各凝血指标差异均无统计学意义(P均>0.05)，说明其多态性并不影响子痫前期患者的凝血功能，也说明这3种基因突变没有明显影响到ZPI的抗凝活性，因此认为这3种基因错义突变并不是蛋白质肽链中关键位置上的氨基酸，故不会引起蛋白质功能改变，但出现了蛋白质多态性。其次，从表2可知，ZPI基因exon-3这3个位点的多态性表达在子痫前期孕妇与健康孕妇之间差异并无统计学意义，说明其基因多态性与是否患子痫前期关系不大。

另外，从3种ZPI 的exon-3基因多态性之间的相关性分析可知，exon-3的181位基因多态性与481位基因多态性密切相关，即181位基因型为AA型的个体在481位基因上均为AA型，181位基因型为AG型的在481位基因上均为AT型，181位基因型为GG型在481位基因上均为TT型，这种基因多态性同步改变，使蛋白质肽链上的氨基酸随之也发生相应改变，这种变化是否是一种巧合，还是有一定的内在关联，是否在维持ZPI蛋白质功能方面会产生积极作用，这些有待于今后进一步研究。

[1]乐杰.妇产科学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2008.92-98，130.

[2]黄斌伦，张浩，金佩佩，等.凝血、抗凝和纤溶指标在深静脉血栓形成诊断中的价值[J].中华血液学杂志，2009，30(3)：196-198.

[3]Laura K Young, Nigel P. Birch, Peter J. Browett ,et al. Two missense mutations identified in venous thrombosis patients impair the inhibitory function of the protein Z dependent protease inhibitor[J]. Thromb Haemost,2012, 107: 854-863.

[4]Ndonwi M, Lu L, Tu Y, et al. Functional analysis of protein Z (Arg-255His) and protein Z-dependent protease inhibitor (Lys-25Arg and Ser-40Gly) polymorphisms. Br J Haematol, 2008, 143(2) :298-300.

RelevantstudyofZPIexon3polymorphismsandbloodcoagulationfunctionofthepreeclampsiaofhypertensivedisordersinpregnancy

MAYaying1,HUANGBinlun2@,WANGmin2,XUQiuxian3,CHENYi3,HEYunqin3

(1. The First People's Hospital of Pinghu, Zhejiang 314200,China；2 Jinhua College of Profession & Technology, Zhejiang 321017,China；3.Jinhua Municipal Central Hospital, Zhejiang 321000,China)

马雅英(1972-)，女，浙江平湖人，本科，主管技师。研究方向：止凝血功能及血栓性疾病

金华市科技局重点资助项目(编号：2009-3-037)

黄斌伦huangbinlun@163.com

R714.24+6

A

1672-0024(2013)06-0042-04

@