小麦WOX转录因子基因的全基因组鉴定与分析

武强强，张凤洁，董浩欢，卢 平，樊 婕，李雪垠，王爱萍，董 琦*

（山西农业大学 a. 农学院，太谷 030801；b. 生命科学学院，太谷 030801）

小麦是一种在我国被广泛种植的谷类作物，其代表种普通小麦（Triticum aestivumL.）是禾本科植物。小麦的常见种在中国还包括提莫非维小麦、一粒小麦、圆锥小麦。小麦是异源六倍体植物（2n=6x=42），有A、B、D 3个基因组，它的基因组庞大（高达17 Gb）且含有大量重复序列。目前小麦的全基因组测序已经完成［1-3］。小麦的种植面积约占世界总耕作面积的17%，提供了全世界约20%的粮食消耗［4］。小麦面粉富含蛋白质、脂质、碳水化合物、矿物质和维生素A等人体必需的营养物质［5］。小麦作为世界上粮食消费最大的产品之一，对保证全世界人类和动物的营养健康有十分重要的作用。因此，对小麦的基础研究一直是植物科学家们关注的重点。

转录因子（transcription factor，TF）也称为反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，并对下游靶基因的转录有调控作用的一种DNA结合蛋白［6］。转录因子具有特定DNA序列的结合活性，能保证靶基因在特定时间和空间以特定强度表达。转录因子作为植物中重要的调控蛋白质，可以调控植物生长发育和对胁迫的应答反应，几乎参与到植物所有的生长发育过程［7］。

2004年，Haecher等［8］在对拟南芥基因组进行全面研究分析后，发现了15个与WUS（WUSCHEL）结构相似的编码蛋白质的基因，并将它们命名为WOX基因。WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族是植物特有的一类基因转录因子。WOX基因家族的功能涉及植物胚胎发育、干细胞维持和器官形成等关键过程，这些功能的发挥与它们可以促进细胞分裂或阻止未成熟细胞的提前分化密不可分［9-10］。小麦WOX转录因子都包含一个非常保守的由65个氨基酸残基组成的DNA结合同源异型结构域（homeodomain，HD），此结构域在WOX转录因子的功能中起着关键作用［11］。随着大量植物基因组测序的相继完成，拟南芥、杨树、水稻、高粱、玉米和茄子中的WOX基因已全部鉴定完成［12-14］，但小麦中WOX基因全基因组的鉴定与分析还不全面。鉴定和分析WOX转录因子基因家族是进一步研究WOX基因功能的重要基础。

本研究运用生物信息学技术手段对普通小麦的WOX基因进行了全基因组鉴定、系统发育树构建、序列分析，为进一步探讨WOX基因调控小麦生长发育的分子作用机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 小麦WOX基因鉴定及蛋白质理化性质分析

从PlantTFDB V4.0数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下载小麦全部WOX基因家族成员［15］。利用Phytozome数据库（V12，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）检索小麦WOX基因的序列信息。利用在线工具ExPASy-Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/，https://web.expasy.org/protparam）对小麦WOX基因编码的蛋白质序列的等电点和分子量进行预测和分析［16］。

1.2 小麦WOX基因系统发育树的构建及基因结构分析

利用Clustal X2软件对小麦WOX基因家族成员的蛋白质序列进行多重序列比对［17］。利用MEGA 5.0软件和邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建系统发育树（bootstrap replications设置为1 000）［18］。利用GSDS 2.0 在线分析软件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析小麦WOX基因的结构［19］。

1.3 小麦WOX基因的蛋白质基序检索和顺式作用元件分析

从Phytozome数据库下载所有小麦WOX基因家族成员的蛋白质序列，以小麦WOX基因上游1.5 kb序列作为启动子序列。利用序列保守基序识别工具MEME（Multiple Em for Motif Elicitation，Version 5.0.3，http://meme-suite.org/tools/meme）鉴定小麦WOX基 因 的 蛋 白 质 基 序［20］。以 PlantCARE 在线分析软件（Plant Cis-Acting Regulatory Elements，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）鉴定小麦WOX基因上游1.5 kb启动子区域内的顺式作用元件［21］。

1.4 小麦WOX基因组织特异性与环境诱导表达分析

将小麦WOX基因序列提交到WheatExp数据库（https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/），下载小麦WOX基因在不同组织和不同逆境条件下的基因表达量数据［22］。利用TBtools工具中HeatMap绘制基因表达热图［23］。

2 结果与分析

2.1 小麦WOX基因鉴定及蛋白质理化性质

基于PlantTFDB V4.0数据库，小麦基因组共有20个WOX转录因子家族基因。根据它们在小麦染色体上的定位情况，把它们分别依次命名为TaWOX1～TaWOX20。利用 ExPASy软件（http://expasy.org）对所有预测的小麦WOX家族成员氨基酸序列进行分子量和等电点的分析，这20个WOX基因的基本信息如表1所示。它们分布在1A～5A、1B、2B、4B、1D～5D染色体上，长度在199～3 694 bp，Ta-WOX20的编码序列（coding sequence，CDS）最长，其蛋白质有322个氨基酸残基，TaWOX9的CDS序列最短，其蛋白质有66个氨基酸残基。

表1 小麦WOX基因基本信息及蛋白质理化性质Tab. 1 Basic information of WOX genes and physicochemical properties of proteins in wheat

2.2 小麦WOX转录因子家族系统进化关系和基因结构

小麦WOX转录因子家族成员系统发育树如图1所示。小麦WOX蛋白质在系统发育树中都是成对出现的，如TaWOX4/TaWOX3等。小麦的20个WOX蛋白质可以划分为3个亚族，不同亚族的亲缘关系较远，同一亚族的亲缘关系较近，由此推测小麦WOX转录因子基因家族在其漫长的演化过程中可能发生了一些适应性变异。基因结构分析显示，所有的基因都含有外显子和内含子结构，有些基因呈现出断裂基因的特征，如TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8均含有3个外显子，所有的基因中以Ta-WOX9最为特殊，其结构最简单，仅含有1个外显子。

2.3 小麦WOX转录因子家族保守基序分析

蛋白质保守基序分析显示，小麦20个WOX蛋白质中共有10个保守基序，分别将其命名为 Motif 1～Motif 10（图2）。TaWOX9仅含有Motif 1 1个基序，而TaWOX2序列不包含任一基序。其中Motif 1存在于除TaWOX2、TaWOX15的剩余18个WOX基因中，Motif 2存在于除TaWOX9、TaWOX2的剩余18个WOX基因中，说明Motif 1、Motif 2在所有的WOX基因的蛋白质基序中最为保守，Motif 1、Mo-tif 2是小麦WOX转录因子的核心基序。Motif 5存在于小麦13个WOX蛋白质序列中，Motif 9存在于小麦的11个WOX蛋白质序列中，这说明Motif 5和Motif 9也是相对较为保守的基序。蛋白质基序Motif 1、2、5、9的保守性很可能与小麦WOX基因功能密切相关。TaWOX10、TaWOX12、TaWOX11、Ta-WOX13的蛋白质基序较类似，这与图1中它们的亲缘关系较近的结论相一致。

图1 小麦WOX转录因子系统进化关系和基因结构Fig. 1 Evolutionary relationship and gene structure WOX transcription factors in wheat

图2 小麦WOX转录因子蛋白质基序Fig. 2 Protein motifs of wheat WOX transcription factors

2.4 小麦WOX基因顺式作用调控元件分析

WOX 转录因子对植物的生长发育、器官形成和干细胞维持等具有重要调控作用。为了探究小麦的WOX 转录因子与植物生长发育的关系，我们分析了小麦WOX基因启动子区域内的顺式作用调控元件。结果显示，小麦16个WOX基因启动子中的顺式作用调控元件主要包括：脱落酸响应顺式作用元件（abscisic acid responsiveness cis-acting element，ABRE）、茉莉酸甲酯响应顺式作用元件（MeJA-responsiveness cis-acting element，CGTCA-motif）、种子特异调控响应顺式作用元件（seed specific regulation cis-acting element，RY-element）、分生组织相关响应顺式作用元件（meristem expression cis-acting element，CAT-box）等（表2）。RY-element主要参与种子的发育过程，CAT-box则主要参与分生组织的形成过程（表3）。TaWOX1、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5基因上游1.5 kb区域内都包含了RY-element和CAT-box 2种顺式作用元件，说明这几个基因作为小麦WOX转录因子家族的成员，与小麦分生组织的形成相关，也很可能与小麦种子或胚乳的发育密切相关。而TaWOX15、TaWOX16基因上游1.5 kb区域内都包含了GT1-motif和Sp1 2种顺式作用元件，说明这2个基因与小麦的光合作用相关。

2.5 小麦WOX基因在不同组织以及不同环境诱导条件下的表达分析

为了探索小麦WOX基因的功能，我们对小麦WOX基因在小麦各个组织部位以及不同环境条件下的表达量数据进行了分析。结果显示：TaWOX1、TaWOX2、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX12、TaWOX19在小麦穗部的表达量较高，推测这9个WOX基因可能参与小麦穗部的发育过程；TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX13在小麦茎中的表达量较高，而在其他小麦组织中的含量相对较低，说明这5个基因参与小麦茎秆的生长发育过程；TaWOX15、TaWOX18、Ta-WOX20在小麦胚乳中的表达量异常高，而在其他组织的表达量几乎为零，因此这3个基因与小麦胚乳的发育密切相关；TaWOX2、TaWOX14在小麦籽粒的表达量较高，其中TaWOX14在其余组织中表达量低，说明TaWOX2、TaWOX14这2个基因与小麦籽粒的形成关系密切。但是在干旱胁迫处理下，20个小麦WOX基因表达量均不显著，几乎为零，说明小麦WOX基因与干旱胁迫下小麦发育不相关。图3所示为小麦在不同生长发育阶段的情况以及WOX基因在不同环境诱导下的基因表达模式。

表2 小麦WOX基因启动子顺式作用调控元件Tab. 2 WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

表3 小麦WOX基因启动子顺式作用调控元件核心序列及功能Tab. 3 Core sequence and functions of WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

3 讨论

小麦是世界上主要的粮食作物之一，小麦生产对保证我国粮食安全和农业可持续发展具有重要的现实意义和战略意义［24］。改良小麦的品质，提高小麦的单产量已经成为国内外研究的热点。全基因组分析目前已成为研究某些物种基因家族最基础的工具，而转录因子因其种类繁多和复杂的作用机制，一直是植物领域研究的热点之一［25］。前人研究结果表明，植物特有的WOX转录因子家族具有多种生物学功能，其家族成员在植物的地上部分、地下部分的发育过程中都发挥着十分重要的作用［1］。

本研究结果显示，小麦共有26个WOX基因，被Phytozome数据库收录且有序列信息的有20个，20个家族成员几乎都含有65个氨基酸残基组成的保守的同源异型结构域，同源异型结构域可以识别特异序列的靶基因并发挥调控作用［1］。小麦的20个WOX基因可分为3个亚族，不同亚族内的WOX基因彼此之间的亲缘关系较近，并且每个亚族内的各个成员之间，在基因结构或蛋白质基序上都具有较强的相似性。本研究中的顺式作用调控元件分析的结果显示，在TaWOX3、TaWOX4、Ta-WOX5、TaWOX6基因的启动子中，均包含CAT-box和RY-element这2种顺式作用元件，据此推测，这几个小麦WOX基因作为WOX转录因子家族的成员，与小麦分生组织的形成有关，也可能与小麦种子或胚乳的发育有重要的联系，其具体功能有待后续进一步研究验证。关于小麦WOX基因在植物各部位的表达数据，其中TaWOX8、TaWOX5、TaWOX6、Ta-WOX10在穗部和茎秆表达量较高，可能调控了小麦穗部和茎秆的发育过程；TaWOX18、TaWOX20、TaWOX15在小麦胚乳中的表达量异常高，而在别的部位的表达量几乎为零，暗示这3个基因可能与小麦胚乳的形成发育密切相关。小麦产量取决于穗数、穗粒数和粒重3种因素，穗的发育与穗粒数密切相关。不同类型分生组织的时空调控对花序的发育和结构特征非常重要，如小穗分生组织的延迟分化作用会引起分枝的重复发生，可以形成大型穗，进而增加穗粒数。下一步将对WOX转录因子基因家族中TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5、Ta-WOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX15、TaWOX18、TaWOX20基因进行克隆与功能研究，验证WOX基因是否可以通过调控小麦穗部、胚乳的发育来改良小麦的农艺性状，进而促进小麦增产。

图3 小麦WOX基因在不同组织和不同环境诱导条件的基因表达模式Fig. 3 Gene expression patterns of wheat WOX genes in different tissues and conditions

总之，本研究借助于生物信息学中的数据库检索与分析，利用生物工具的绘图功能，鉴定并分析了小麦的WOX转录因子基因家族，为后续小麦植物生长发育相关WOX基因的克隆和功能研究奠定了理论基础。