不同地区的紫苏种子中总黄酮的提取方法及其含量研究

李 锐，李皎皎，张聪聪，周 茜，高荣琨

（山西农业大学 a. 基础部；b. 动物医学学院，太谷 030801）

紫苏［Perilla frutescens（L.）Britt.］属于唇形科，一年生草本植物［1-2］。几个世纪以来，紫苏一直在东亚国家特别是在中国和日本被广泛应用，如可以用来做药材，可以榨油，也可以应用于化妆品等方面［3-4］；有些地区还将它用于饮食，如紫苏叶子用于亚洲美食中的寿司、配菜和汤［5-7］。近些年来，紫苏因其特有的活性物质及营养成分成为一种倍受世界关注的多用途植物，其经济价值很高，是可以直接开发的野生植物资源［8-9］。

紫苏中备受关注的化学成分多种多样。目前虽已有紫苏中相关活性成分的测定研究报道，如马立丽等［10］报道紫苏总黄酮具有显著的健康效益，可作为食品添加剂用于预防高脂血症；陈建欣等［11］报道了不同部位紫苏中黄酮含量不同；秦红英等［12］报道了用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定紫苏中的有机酸和黄酮的含量；张蕾蕾等［13］报道了用微波法测定紫苏中总黄酮类物质及其成分分析；李秀信等［14］报道了紫苏茎中黄酮类化合物的提取及鉴定。而紫苏种子中黄酮类化合物的系统研究尚未见报道。因此，本研究通过加热、超声波辅助萃取检测提取温度、提取时间和提取剂浓度对紫苏种子中总黄酮提取的影响，目的是优化紫苏种子中黄酮的提取方法，探究不同地区紫苏种子中总黄酮含量的差异，以及采用HPLC分离紫苏种子中的两种主要有效成分芦丁和木犀草素，以期为今后开发利用紫苏资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

研究材料来自山西农业大学农学院王计平老师实验室在同一地点种植的来自于不同地区的紫苏种子。于秋季籽粒饱满时，将种子采集回实验室，放置自然风干，然后收集保存备用［15-16］。本试验的紫苏来自于贵州都匀、辽宁阜新、宁夏中宁和陕西蓝田。

1.2 方法

采用许纲等［17］的方法配制标准溶液，配制芦丁标准品溶液0.3 mg/mL，在紫外可见分光光度计上进行全波长扫描，确定最大吸收波长（图1）。之后，在最大吸收波长处测定不同浓度标准溶液的吸光度。然后以吸光度（absorbance，A）为纵坐标，浓度（concentration，C）为横坐标，绘制芦丁标准曲线（图2），得线性回归方程：y=8.206 3x；R2=0.978 0。

将试验所需的紫苏种子自然风干后，放入研钵中研碎，研磨至成膏状物体即可（由于油脂过多无法过网）。基于加热和超声波辅助提取原理，对紫苏种子黄酮进行提取，提取完1 h内，利用亚硝酸钠-硝酸铝比色法在λ=504 nm处采用紫外可见分光光度计测定产物的吸光度值，并计算其浓度。试验重复3次。

图1 芦丁的全波长扫描结果Fig. 1 Full wave scanning results of rutin

图2 芦丁标准曲线（λ=504 nm）Fig. 2 Standard curve of rutin (λ=504 nm)

HPLC条件：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5μm），甲醇-0.4%磷酸［V（甲醇）∶V（0.4%磷酸）=53∶47］作为流动相，紫外检测器检测波长为320 nm，常温，流速为1.0 mL/min［4］。进样分析试验重复3次，得到芦丁和木犀草素的标准图谱（图3），图谱清晰明辨，说明可以用此方法来测定未知样品。

然后以标准溶液的含量为横坐标，峰面积为纵坐标作高效液相色谱标准曲线，结果得到芦丁回归方程为y=16 166x，R2=0.999 6（图4），木犀草素的回归方程为y=19 490x，R2=0.989 0（图5），两者在相应范围内都呈现了良好的线性关系。

图3 芦丁、木犀草素标准样品HPLC图谱Fig. 3 HPLC chromatograms of rutin and luteolin

图4 芦丁峰面积与浓度的关系Fig. 4 Relationship between peak area and concentration of rutin

图5 木犀草素峰面积与浓度的关系Fig. 5 Relationship between peak area and concentration of luteolin

1.3 数据统计与分析

使用Excel和DPS统计分析软件进行数据分析。对紫苏种子中黄酮含量进行单因素方差分析（one-Way ANOVA）和Duncan多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。方差分析前对黄酮含量进行正态分布和方差齐性检验，试验数据符合条件，故不需要进行数据转换。

2 结果与分析

2.1 提取时间和温度对黄酮得率的影响

时间和温度对紫苏种子中黄酮的得率起关键作用。在不同温度下，随着提取时间的增加，黄酮得率都呈现出先增后减的趋势，高温下更加明显。如图6所示，在提取的前120 min，不同温度下总黄酮的提取率随时间急剧增加，差异极显著（t=70℃，F=344.170 0，P=0.000 1；t=50℃，F=198.450 0，P=0.000 1）。且70℃下在120 min时提取液中黄酮含量提取率最高，可达（4.39±0.05）%。在120 min后时间效应逐渐减弱，因此一个较长的提取时间一般是有益的。而且可以明显看出，黄酮类化合物在提取30～120 min之间产生，因此从加热30 min开始至120 min的时间最适合黄酮类化合物的提取。紫苏种子中总黄酮含量低于紫苏叶中的总黄酮含量。

不同温度下随着时间的延长黄酮得率的变化趋势一致，但升高温度黄酮类化合物的得率明显提高。如图6所示，其中120 min时黄酮提取率从50℃时的（3.21±0.08）%增加到70℃时的（4.39±0.05）%。然而由于乙醇的沸点较低，70℃可能是紫苏种子总黄酮提取的最佳温度。

图6 提取时间对黄酮得率的影响Fig. 6 Effects of extraction time on the yield of flavonoids

2.2 提取剂浓度对黄酮得率的影响

本研究以乙醇溶液为萃取剂，在固定提取时间（120 min）、提取温度（70℃）和料液比［质量（g）和液体体积（mL）的比为1∶20］下进行提取试验，探讨不同浓度的乙醇溶液对黄酮类化合物提取率的影响（图7）。结果表明，乙醇浓度对黄酮类化合物的提取有影响。乙醇的质量分数为80%时总黄酮化合物提取率为（4.39±0.05）%，乙醇的质量分数为95%时总黄酮化合物提取率为（5.52±0.09）%，差异显著（P=0.001 6）。因此，总黄酮类化合物的提取用质量分数为95%的乙醇较好。

图7 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig. 7 Effects of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.3 不同提取方法下紫苏种子中黄酮得率的比较分析

图8 不同提取方法对黄酮得率的影响Fig. 8 The effects of different extraction methods on the yield of flavonoids

经不同的方法提取紫苏种子中的总黄酮，发现有明显的不同（图8）。传统的加热法下总黄酮含量在120 min内随时间的延长而增加，120 min后却逐渐降低。而超声波辅助萃取时，总黄酮含量在90 min内随时间的延长而增加，90 min后却逐渐降低，且超声波辅助萃取的最高总黄酮量低于加热法提取的最高总黄酮量。这表明超声波辅助不利于紫苏种子中黄酮的长时间提取，推测可能长时间的超声波萃取破坏了黄酮物质。这与Wong等［18］报道的用超声波提取法从植物中提取黄酮类化合物是一种可行方法，但其有效性在很大程度上取决于萃取条件，如萃取剂浓度、萃取温度、萃取时间、料液比等相一致。

2.4 不同地区紫苏种子中总黄酮含量的比较分析

为了考察来自不同地区在同一地方种植的紫苏种子中黄酮类化合物是否有差异，抽取4个地区进行试验。结果显示，不同地区之间紫苏种子总黄酮含量差异极显著（F=59.739 0，P=0.000 1）。如图9所示，所有参试的种子总黄酮含量平均值由左到右分别为（2.63±0.11）%、（3.55±0.19）%、（4.55±0.02）%和（4.39±0.05）%，其含量变异范围为2.63%～4.55%。所有参试材料中，宁夏中宁材料种子中总黄酮含量最高，为陕西蓝田的1.73倍。显然宁夏中宁和贵州都匀是生产类黄酮的科学本种，黄酮类化合物含量高且易得。说明在紫苏种质资源中可以筛选出总黄酮含量低的陕西蓝田，总黄酮含量高的宁夏中宁和贵州都匀可作为特用种质材料，从而有利于开展紫苏总黄酮的优质育种工作。

图9 不同地区紫苏种子中黄酮的含量Fig. 9 The content of flavonoids in Perilla frutescens seeds from different regions

2.5 HPLC对紫苏种子中黄酮种类的分析

将制备好的样品溶液在HPLC条件下进样测定，每个样品重复3次，得到样品图谱（图10），取其平均值，采用外标法计算芦丁和木犀草素的含量。结果显示，同一地方种植的来自不同地区的紫苏种子中芦丁、木犀草素的含量存在较大差异。4种紫苏种子中都含有一定量的芦丁，其含量在（0.82±0.31）%～（5.62±0.91）%，各紫苏种子中芦丁的含量从高到低为：宁夏中宁＞陕西蓝田＞贵州都匀＞辽宁阜新（图11）。不同地区紫苏种子中木犀草素的差异显著，贵州都匀和辽宁阜新紫苏种子中含有木犀草素，含量分别为（0.59±0.02）%、（0.52±0.03）%，陕西蓝田和宁夏中宁中没有检出木犀草素（表1）。

图10 不同地区紫苏种子样品的HPLC图谱Fig. 10 HPLC chromatograms of purified flavonoids in Perilla frutescens seeds from different regions

图11 不同地区紫苏种子中芦丁的含量Fig. 11 Content of rutin in Perilla frutescens seeds from different regions

表1 不同地区紫苏种子中木犀草素的含量Tab. 1 Content of luteolin in Perilla frutescens seeds from different regions

3 讨论

黄酮类化合物是一类次生代谢产物，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等中，数量种类繁多，结构复杂，具有解热、抗微生物、止呕、抗肿瘤、抗凝、止血、抗炎、抗过敏等活性，并具有较强的抗氧化作用［19］，因此，富含黄酮的材料利用价值高。黄酮类化合物在乙醇溶液中的浸出率较高，且提取液较易浓缩和干燥，因此，乙醇是一种好的提取剂［19］。但相关紫苏中黄酮的文献报道不一，且尚未有对于紫苏种子中黄酮的分离测定的详细报道。本试验发现乙醇溶液的浓度、提取温度、提取时间不同，紫苏种子中黄酮类的浸出率不同。加热提取中采用80%的乙醇溶液，温度为70℃，提取时间为120 min时紫苏种子中黄酮类的浸出率最高；采用超声波辅助法提取短期内加速了黄酮类物质的浸出，但不利于长期提取，建议如果是需要尽可能浸出所有的黄酮类物质应采用加热提取法。

马尧等［20］的研究表明，紫苏不同部位总黄酮含量不同。本试验发现：紫苏种子中的总黄酮含量小于紫苏叶中的总黄酮含量；不同地区的紫苏种子中黄酮类组成和含量不同，宁夏中宁的黄酮含量是陕西蓝田的1.73倍，而且差异极显著（P＜0.01）。张蕾蕾等［13］的研究表明，紫苏中主要黄酮类物质是芦丁和木犀草素。本试验发现来自不同地区的紫苏在同一地方种植所获得的紫苏种子中芦丁和木犀草素的含量差异显著。贵州都匀紫苏种子中芦丁含量为（1.46±0.24）%，木犀草素含量为（0.59±0.02）%，而宁夏中宁中芦丁含量为（5.62±0.91）%，木犀草素含量极少，差异极显著（P＜0.01）。这可能是由于不同地区的紫苏中黄酮具有不同的积累和调控途径。但关于紫苏种子中黄酮的积累机制和品种的鉴定还有待进一步的研究。

总之，紫苏种子材料中总黄酮的组成和含量存在较大的差异，总黄酮含量变化值为2.63%～4.55%，可为紫苏品种的改良提供优质材料。紫苏种子中的黄酮类化合物采用加热浸提法是一种可行、有效的提取方法，总黄酮的提取率较高。总黄酮的最佳提取条件：乙醇质量分数为80%，温度为70℃，料液比为1:20，浸提时间为120 min。本试验建立了HPLC分离测定紫苏种子中的芦丁和木犀草素成分的方法，该方法操作简单、检出限低、灵敏、准确，为紫苏中黄酮的质量评价提供了科学依据。