玫瑰花提取物对砷胁迫下酵母细胞凋亡抑制的研究

武晓英，李 博，吴丽华，曹贵东，乔宏萍*

（1.太原师范学院生物系，晋中 030619；2.山西瑞象生物药业有限公司，太原 030032）

砷中毒是一个全球性的公共卫生问题，包括我国在内的世界许多国家地下水砷的含量都严重超标[1-3]，山西属于高砷地下水分布区[4-5]。鉴于砷对生物组织、器官的毒害作用[6-9]，国际癌症研究中心已将砷确定为人类致癌物[10-11]。砷的毒性研究主要集中在氧化损伤和细胞凋亡方面[12-14]，其可以诱导生物产生活性氧来破坏机体的抗氧化系统，从而引发组织损伤、机体炎症以及细胞凋亡[15-16]。砷诱导的细胞凋亡已被广泛研究，已有的研究表明，砷可通过氧化损伤诱导人的肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cell，HK-2）凋亡[17]。近年来，从天然产物中筛选、开发抗氧化剂已成为新的研究热点。玫瑰花（Rosa rugosa）因其高的药食两用价值被载入《食物本草》中，除具有较强的抗氧化、抗癌、抗菌和抗病毒等生理活性外，还可以有效降低细胞的氧化损伤[18-20]。因此，该试验以模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为对象，在砷胁迫下诱导酵母细胞氧化损伤，通过添加玫瑰提取物（rose extract，RE），以抗坏血酸（ascorbic acid，Vc）作为对照，揭示了 RE对酵母细胞的抗氧化作用机制，为治疗人类疾病提供了一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验设计与试验材料

试验分6组，分别为酿酒酵母/对照组（control group，C组）、酿酒酵母 +1.5 g/L RE培养组（RE组）、酿酒酵母+0.1 g/L Vc培养组（Vc组）、酿酒酵母+1.0 mmol/L 亚砷酸钠（sodium arsenite，As）培养组（As组）、酿酒酵母+As+RE培养组（As+RE组）和酿酒酵母+As+Vc培养组（As+Vc组）。

干制苦水玫瑰花50 g，产地甘肃，购自同仁堂药店。酿酒酵母GGMCC2.1882购自中国科学院研究所菌种保藏中心。

1.2 RE的制备

将玫瑰花粉碎称取50 g，加90%乙醇浸泡过夜，采用乙醇加热回流法提取玫瑰花的粗提物，经旋转蒸发浓缩至2 g/mL，100℃间歇性灭菌后，4℃保存备用。

1.3 Vc、RE清除DPPH的半抑制量计算

Vc 取 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 g/L 6 个质量浓度梯度，RE 取 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L 6个质量浓度梯度，每个质量浓度设置3个重复，分别加入质量浓度为0.03 g/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH），利用OD517nm的吸光度值计算 Vc和RE DPPH（南京建成生物工程研究所，南京）的清除率，用Vc和RE的含量（X axis，X）对DPPH的清除率（Y axis，Y）做散点图，进一步做出线性方程。试验中RE和Vc的添加以50%DPPH清除率为标准。

1.4 不同浓度砷胁迫下酵母细胞的生长曲线测定

在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）中分别加入 0.0、0.5、1.0和2.0 mmol/L的As；取相同体积对数生长期酵母细胞接种于培养基中，28℃、150 r/min恒温震荡培养，培养期为24 h，每隔2 h连续测定OD600nm的值；绘制横坐标为培养时间，纵坐标为OD600nm吸光度值的酵母生长曲线，通过酵母细胞的生长曲线选择砷胁迫酵母的添加浓度。

1.5 RE对砷胁迫下酵母细胞生长抑制率和噻唑蓝（MTT）细胞增殖的影响

生长抑制率：取对数期相同体积的经活化的酵母细胞菌悬液，按照6个不同处理组进行培养，每个处理组重复3个样本，150 r/min、28℃连续恒温振荡培养24 h后测定OD600nm的值，以C组的OD值为对照组参数，其他组OD值为处理组，计算每组生长抑制率公式为：生长抑制率（%）=（1-OD处理/OD对照）×100%。

噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）细胞增殖检测：培养24 h后的不同处理组酵母细胞同时进行MTT细胞增殖检测，检测方法按照南京建成生物工程研究所MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）的说明进行操作，用酶标仪在570 nm波长处检测吸光度值。

1.6 酵母细胞的存活率检测

将不同处理组中过夜培养的酵母菌分别稀释100、101、102、103和 104倍，各取 5 μL 滴于 YPD 固体平板上，置于28℃恒温培养箱中培养，24 h、48 h后观察菌落的生长情况。

1.7 酵母细胞的FDA/PI染色法

不同处理组分别取1 mL过夜培养的酵母菌，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）反复洗涤2次后离心收集细胞，在酵母细胞中加入荧光素二乙酸/碘化丙锭（fluorescein diacetate/propidium lodide，FDA/PI）染色液（Sigma corporation，美国），振荡摇匀后，在室温下进行避光反应10 min，吸取5 μL细胞悬液用荧光显微镜检测酵母细胞的活性。

1.8 酵母细胞核的DAPI染色法

不同处理组分别取1 mL过夜培养的酵母菌，经离心沉淀后，用1 mL PBS缓冲液重复洗涤并收集酵母细胞。在4℃冰箱中，用1 mL 70%的乙醇固定2 h后，用1 mL PBS重复洗涤离心并去除上清液，在沉淀中加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（diamidine phenyl indole，DAPI）染色液（南京建成生物工程研究所，南京）振荡摇匀，在室温下避光10 min后用1 mL PBS缓冲液反复离心洗涤，取5 μL细胞悬液在荧光显微镜下观察细胞核的形态。

1.9 酵母细胞凋亡检测

取过夜培养的酵母细胞，加入Annexin V-FITC/PI（南京建成生物工程研究所，南京）进行双染，室温避光孕育10 min后通过流式仪对凋亡的细胞进行检测。

1.10 数据分析

试验数据采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和多重比较。组间的差异显著性用字母表示，不同的小写字母表示差异显著（P<0.05），不同的大写字母表示差异极其显著（P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 Vc、RE 清除 DPPH 的半抑制量（IC50）

由图1、2结果可知：Vc在低质量浓度下有很强的抗氧化性；在0.05～0.80 g/L的质量浓度范围内，Vc的质量浓度与清除率线性相关，可以用Vc对DPPH的清除率来表示抗氧化能力，Vc的50%抑制质量浓度（50%inhibitive concentration，IC50）为 0.10 g/L；高质量浓度的RE也有很强的抗氧化性，在RE质量浓度为0.50～3.00 g/L范围内具有线性相关，可以用DPPH的清除率表示RE对自由基的清除能力，RE的 IC50为 1.50 g/L。

2.2 砷对酵母细胞生长的影响

酵母细胞生长曲线的测定比较了不同浓度As对酵母细胞的胁迫作用，通过比较选择胁迫作用明显但并没有完全抑制酵母细胞生长的浓度作为砷的胁迫浓度。由图3的生长曲线可知：酿酒酵母在正常培养情况下，8～18 h之间进入快速生长的对数期，16 h后进入缓慢生长的稳定期；在酵母细胞培养液中加入As后，随着添加浓度加大，酵母细胞生长受到抑制，当As浓度为2.0 mmol/L时，酵母生长停滞，当As浓度为1.0 mmol/L时，与正常组和低浓度组相比，酵母虽没有被完全抑制，但生长极其缓慢。故试验选取1.0 mmol/L作为砷胁迫酵母细胞的添加浓度。

图1 Vc的DPPH清除率标准曲线Fig.1 DPPH clearance standard curve of Vc

图2 RE的DPPH清除率标准曲线Fig.2 DPPH clearance standard curve of RE

图3 不同浓度砷胁迫下酵母细胞的生长曲线Fig.3 Growth curve of yeast cell under As stress in different concentrations

2.3 RE对砷胁迫下酵母细胞抑制率和生长率的影响

As的浓度为1.0 mmol/L时，其对酵母细胞的生长有明显的抑制作用，试验通过添加Vc和RE比较了不同添加物对砷胁迫下酵母细胞生长率和抑制率的影响。结果如图4显示：在酵母细胞培养液中添加RE对酵母细胞的正常生长无影响，培养24 h后，C组和RE组的生长抑制率最低，两组之间差异不显著（P>0.05）；在酵母细胞培养液中添加Vc，酵母细胞生长抑制率虽然低，但Vc组生长抑制率显著高于C组和RE组（P<0.05）；在酵母细胞培养液中添加As，As组生长抑制率最高达68%，极显著高于其他组别（P<0.01）；酵母细胞在砷胁迫的情况下添加RE后，尽管生长抑制率极显著高于C组、RE组和Vc组（P<0.01），但生长抑制率明显降低，As+RE组抑制率显著低于As+Vc组（P<0.05）。

图4 不同培养组酵母细胞抑制率的比较Fig.4 Comparison of inhibition rate of yeast cell in different culture groups

图5中MTT检测酵母生长率结果显示：C组、RE组和Vc组酵母细胞的生长率高，RE的添加对酵母细胞生长无影响，RE组和C组组间差异不显著（P>0.05），但RE组酵母的生长率显著高于Vc组（P<0.05）；培养液中添加As后，严重抑制了酵母细胞的生长，As组生长率最低，极显著低于其他组别（P<0.01），当砷胁迫酵母培养液中添加RE后，As+RE组生长率显著高于As+Vc组（P<0.05）。

2.4 RE对砷胁迫下酵母细胞存活率的影响

图5 不同培养组酵母细胞生长率的比较Fig.5 Comparison of yeast cell growth rate in different culture groups

平板点样法是检测酵母细胞存活率的经典方法，试验通过10倍梯度稀释平板点样法比较了Vc和RE的添加对砷胁迫酵母细胞存活率的影响。由图6、7可知：无论培养24 h还是48 h，在没有砷胁迫的情况下，在培养液中添加RE，酵母细胞的生长和存活率均明显高于Vc组，与C组差异不显著，培养48 h后，RE组和C组均可在104稀释倍数下观察到清晰的菌落生长，但Vc组在104稀释倍数下观察不到菌落生长；在砷胁迫下，酵母细胞生长受到抑制，As组仅在101稀释倍数下可以看到生长的菌落，当培养液中添加RE后，As+RE组细胞的存活率明显高于As+Vc组别，As+RE组可在103稀释倍数下看到清晰的菌落生长，但As+Vc组仅能在102稀释倍数下观察到生长的菌落。

图6 不同培养组24 h酵母细胞存活率的比较Fig.6 Cpmparison of survival rate of yeast cell cultured for 24 h in different culture groups

2.5 RE对砷胁迫下酵母细胞FDA/PI双染的影响

图7 不同培养组48 h酵母细胞存活率的比较Fig.7 Cpmparison of survival rate of yeast cell cultured for 48 h in different culture groups

As浓度为1 mmol/L时，其对酵母细胞的生长有明显的抑制效应，但无法判断酵母细胞的存活状态。FDA/PI双染则可以通过显微镜观察区分死亡细胞和存活细胞，从而进一步比较Vc和RE的添加对砷胁迫酵母细胞存活状态的影响。从图8、9可知：添加RE对酵母的正常生长没有影响，RE组与C组中FDA染色的存活绿色荧光细胞多，PI染色的死亡红色荧光细胞少，两组之间酵母细胞死亡率低且差异不显著（P>0.05）；在Vc组中可以明显观察到死亡的红色荧光细胞，其细胞死亡率显著高于RE组和C组；在培养液中添加As后，在相同的观察视野中酵母细胞数很少，说明砷不但明显抑制酵母细胞的生长，而且死亡细胞极显著高于其他组别（P<0.01）；RE和Vc的添加缓解了砷胁迫下酵母细胞生长的抑制和死亡，但相较于RE+As组，Vc+As组的酵母细胞死亡更明显（P<0.05）。

图8 不同培养组酵母细胞FDA/PI染色的比较Fig.8 Comparison of FDA/PI staining of yeast cell in different culture groups

2.6 RE对砷胁迫酵母细胞核DAPI染色的影响

图9 不同培养组酵母细胞FDA/PI染色相对死亡率的比较Fig.9 Comparison of yeast cell relative mortality by FDA/PI staining in different culture groups

DAPI为细胞核染液，可以在显微镜下观察并比较Vc和RE的添加对砷胁迫酵母细胞核凋亡的影响。图10结果显示：C组、RE组和Vc组经DAPI染色的酵母细胞核呈现规则的圆形，且正常均匀分布在细胞中，细胞凋亡现象不明显；而As+RE组、As+Vc组和As组中细胞核有固缩且聚集在细胞一侧的现象，尤其在As组中，细胞凋亡现象明显，细胞核固缩且核内染色质发生降解，同时可以观察到凋亡细胞体积变大。在培养液中添加RE和Vc后缓解了酵母细胞的凋亡，且添加RE后的缓解作用优于Vc。

图10 不同培养组酵母细胞DAPI染色的比较Fig.10 Comparison of DAPI staining of yeast cell in diffierent culture groups

2.7 RE对砷胁迫下酵母细胞凋亡的影响

酵母细胞凋亡除采用DAPI细胞核染色形态学观察外，也可以通过Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞凋亡检测，比较Vc和RE的添加在不同细胞周期对砷胁迫酵母细胞凋亡的影响。其结果如图11、12显示，通过图中四个象限中细胞数的变化可知：C组和RE组间细胞凋亡率无显著差异（P>0.05），两组图中增殖的酵母细胞主要存在于左下象限中，仅有少数早期凋亡细胞存在于右下象限中，且凋亡率低；Vc组细胞凋亡率显著高于RE组和C组（P<0.05），图11中除左下象限中增殖的酵母细胞外，右下象限中早期凋亡细胞数明显增多；砷胁迫下，As组酵母细胞的凋亡极显著提高（P<0.01），细胞相对凋亡率中包括了右下象限的早期凋亡细胞、右上象限的晚期凋亡细胞和左上象限中的死亡细胞；添加RE和Vc后，酵母细胞相对凋亡率极显著下降（P<0.01），RE+As组中早晚期凋亡细胞和死亡细胞数明显减少，RE组的细胞凋亡率显著低于Vc+As组（P<0.05）。Annexin V-FITC/PI双染流式检测酵母细胞凋亡结果与DAPI细胞凋亡检测结果一致。

图11 不同培养组酵母细胞凋亡的比较Fig.11 Comparison of cell yeast apoptosis in different culture groups

图12 不同培养组酵母细胞凋亡率的比较Fig.12 Comparison of yeast cell apoptosis rate in different culture groups

3 讨论

流行病学研究显示，环境饮水型砷中毒破环了机体的抗氧化防御系统，增加了肺癌、皮肤癌等各种癌症的风险[21-23]，同时还与心脑血管疾病、生殖毒性等疾病紧密相关[24-25]。本试验以酿酒酵母为对象，因其具有像细菌一样的简易操作性，已发展成为研究人类凋亡、疾病以及衰老等的优势工具菌种[26-29]。为确定砷胁迫酵母的浓度，试验将不同浓度的As添加在培养液中判断其对酵母细胞生长的影响。当浓度为1.0 mmol/L时，酵母生长极其缓慢，但没有停滞，通过对酵母的生长率、抑制率、存活率和凋亡率等进行检测发现，1.0 mmol/L As的添加极显著降低了酵母的生长率与存活率，且极显著提高了酵母细胞的凋亡率，可确定该浓度为砷胁迫酵母细胞的添加量。

近年来，天然植物及植物提取物因功能强、无毒、环保等诸多优点[30]而成为研究热点。白藜芦醇[31]和甘草多糖[32]等多种抗氧化物质被证明具有提高机体抗氧化力、缓解氧化损伤的功能。Vivancos等[33]报道，植物甾醇可以通过增加抗氧化酶活性提高抗氧化作用。玫瑰花富含黄酮、多酚等各类物质，对肿瘤疾病有一定的治疗作用[34]。在该试验中，我们选取DPPH清除率同为50%的Vc（0.10 g/L）和RE（1.50 g/L）作为细胞凋亡抑制剂，以Vc为参照，利用RE的添加来改善砷对酵母细胞的胁迫作用。从试验结果可知，酵母细胞的生长率和存活率极显著提高，抑制率和凋亡率极显著下降，说明RE作为天然植物提取物有非常好的抗氧化作用。同时试验结果还显示，无论是在非胁迫状态下RE组和Vc组之间比较，还是在砷胁迫状态下As+RE组和As+Vc组之间比较，添加RE的组别酵母细胞生长率和存活率都显著高于添加Vc的组别，酵母细胞的生长抑制率、死亡率和凋亡率都显著低于添加Vc的组别。已有研究证实，绿茶提取物表现出多重作用机制，对正常细胞无害，但能加速癌细胞凋亡，对癌变细胞起到积极的治疗作用[35-36]。RE的作用机制同样具有多重效应，其添加对正常酵母细胞无害，但对砷胁迫下的酵母细胞起到了积极的损伤修复作用。我们推测其原因为Vc是单一成分抗氧化剂，在体外具有很强的清除自由基清除反应的能力，因此其对DPPH的清除率效果明显高于RE。但当Vc作用于体内时，因受到复杂的基因调控的影响，故对使用剂量有严格的控制，而50%DPPH清除率的Vc添加量可能已超出其体内使用的安全阈值，因此，试验中无论作用于正常酵母细胞或砷胁迫下的酵母细胞，Vc的作用效果都低于RE。RE是混合天然提取物，提取物中含有十多种甚至上百种的天然成分，其功能可能具有多重效应，但是具体的作用机制还有待进一步研究。

综上所述，RE是一种非常好的抗氧化剂，在1.5 mmol/L的添加浓度下，对正常酵母细胞的生长没有任何影响，对砷胁迫的酵母细胞可以提高其生长率和存活率，降低细胞的生长抑制率、死亡率和凋亡率。该试验同时证实了RE作为天然植物提取物，其绿色、无毒的作用机制将在对抗重金属污染、提高机体抗氧化力、缓解氧化损伤等方面有着更广阔的应用前景。