腐败变质鸡蛋内容物细菌群落多样性分析

申田宇，陈力力，刘 焱，刘 金，陈 欢，张立钊，蒋立文

(1.湖南农业大学食品科技学院， 长沙 410128； 2.食品科技和生物技术湖南省重点实验室， 长沙 410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心， 长沙 410128)

鸡蛋的腐败过程十分复杂，是微生物、环境因素和鸡蛋本身特性三者互为条件发生综合作用的结果，其中起主要作用的是不同种类的微生物。正常健康母鸡刚产下的蛋，其内容物中很少有微生物存在，这是因为蛋壳外表层有一种由输卵管腺体分泌的透明黏质蛋白质形成的以白垩有机物或香脂类为主的无机物保护膜，具有防止水分丧失和细菌侵袭的能力[1]；但是这种保护功能随着鸡蛋贮存时间的延长和环境因素影响而逐渐下降，导致附着在蛋壳表面的细菌通过水平感染途径侵入蛋内得到繁殖。在鸡蛋贮藏过程中，尤其是未经过清洗、消毒等洁蛋处理的新鲜鸡蛋，由于环境气候、鸡蛋营养物质丰富等因素的影响，非致病性腐败细菌如肠杆菌(Enterobacteriaceae)、肠球菌(Enterococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)等从蛋壳表面侵入并大量繁殖，从而造成鸡蛋腐败变质[2]。在此过程中，各种腐败菌竞争能力与代谢特征的差异会造成鸡蛋腐败的时间和特征不同，对鸡蛋品质的影响也不同。如浓厚蛋白减少逐渐转化为稀蛋白，出现蛋白液化；蛋黄膜失去弹性而破裂,蛋清和蛋黄混合；蛋液混浊不清,稀薄。在发生组织状态变化的同时，营养物质分解并产生具有腐败气味、强烈剌激性臭味、胺类臭味的物质。这些蛋白液化和腐败发臭变化可以以哈夫单位、气室高度、蛋清pH、蛋黄指数、蛋白的持水能力、挥发性盐基氮含量等蛋品新鲜度一般理化指标来评价。对于鸡蛋微生物污染的研究，人们采用传统的微生物分离培养方法对不同来源鸡蛋细菌污染情况进行调查[3-5]，而对采用非培养的研究手段，如高通量测序分析变质鸡蛋内容物细菌的菌相特点以及在鸡蛋内的代谢特点报道较少。同时，人们的研究着重在引起食物中毒、对人体健康带来危害的致病菌方面，而鸡蛋主要腐败菌及其导致鸡蛋变质的微生物过程和生物化学过程还有待进一步深入研究。

本文采用高通量测序技术，以腐败鸡蛋内容物细菌基因组DNA为模板进行Miseq测序，研究腐败鸡蛋内容物的细菌种群结构和菌相变化，为进一步分离鸡蛋主要腐败菌，研究其生物学特性、致腐能力、与鸡蛋品质劣变之间的关系以及为控制鸡蛋腐败菌对鸡蛋品质的影响奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品材料

变质鸡蛋为市场购买的新鲜鸡蛋，经盒装放置实验室室温条件下贮存至蛋白液化或有明显臭气味。

1.1.2 试剂与仪器

Easy Pure Genomic DNA Kit(H30909)试剂盒、凝胶回收试剂盒及PCR扩增试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

HC-1016高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，JY300C型通用电泳仪(上海百典仪器设备有限公司)，9700型PCR仪(爱普拜斯公司)，SW-CJ-IF净化工作台(上海新苗医疗机械制造有限公司)，LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品细菌基因组DNA提取及PCR扩增

以室温下贮存至变质的鸡蛋样品为研究对象，选取蛋白液化鸡蛋[哈夫单位平均(26.85±1.81)]和臭鸡蛋[挥发性盐基氮平均值为(61.13±0.40)mg/100 mL]各3枚，分别制备混合样品J(蛋白液化鸡蛋内容物)、JC(发臭鸡蛋内容物)，即无菌操作将鸡蛋内容物倒至带玻璃珠的灭菌三角瓶中，充分振摇备用。按照试剂盒说明书分别抽提样品基因组DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳及采用分光亮度计在260 nm和280 nm下测定吸光度，计算OD260/OD280比值进行DNA质量检测，PCR扩增反应前用Tris-HCL缓冲液将模板DNA稀释为5 ng/μL。

根据Miseq测序区域(V4+V5)，以提取的质量合格的DNA作为模板，采用合成带有barcode的特异引物Primer 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)及Primer 806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行细菌16S rDNA PCR扩增。PCR扩增为20 μL反应体系，即5×FastPfu Buffer 4.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、Forward Primer(5 μmol/L) 0.4 μL、Reverse Primer(5 μmol/L) 0.4 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、 Template DNA 10 ng，最后补ddH2O 至 20.0 μL。PCR反应参数为：变性95 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，共27个循坏。随后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.2 Miseq测序及数据分析

我们有理由相信，民勤的这种自强不息的精神，与文化的力量紧紧相连，定会产生一种更加强大的创造力和文化自信。她连结着沙漠，连结着民勤那久远而深厚的人文历史；连结着智慧勤劳的民勤人民。她将会以生生不息的原动力，形成永远伫立着的座座艺术丰碑！

将上述PCR产物进行切胶纯化(Qiagen胶回收试剂盒)，浓度用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.USA)测定，并采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega 公司)进行定量检测，随后，按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合和MiSeq文库构建，Miseq测序由上海美吉生物医药科技有限公司llumina完成。

首先根据overlap关系对Miseq测序得到的PE reads进行拼接，采用Trimmomatic、FLASH对序列质量进行质控和过滤，根据barcode区分样品后，采用软件Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)，在相似度为97%水平下，对所有序列进行操作分类单元(operational taxonominc unit, OTU)划分聚类分析和物种分类学分析。基于OTU聚类分析结果，采用mothur软件及菌群丰度指数计算法对OTU进行群落的物种丰度和多样性指数分析，用于指数评估的OTU相似水平为97%，另外基于分类学信息，在不同水平上对各样品进行群落结构的统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品序列及取样深度验证

样品总基因组DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,电泳目的条带清晰。另外，J、JC样品的OD260/OD280分别为2.06和1.97，质量浓度分别为51.20 ng/μL和86.70 ng/μL，浓度和纯度均符合PCR扩增要求。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其目的条带的浓度和大小合适，符合下一步核酸序列测序要求。Miseq测序J及JC样品分别获得42 550条、38 477条优化序列。在OTU相似水平97%下，最终序列平均长度为450 bp左右，且测序长度上下浮动不大，说明得到的序列可以用于后续分析。从样本中随机抽取一定数量的序列与它们所代表的物种数目构建稀释曲线，其稀释曲线逐渐趋于平坦，说明数据量越多对于发现新的OTU边际会越小，可以进行下一步的数据分析。

2.2 样品多样性分析

2.2.1 多样性指数分析

表1中两样品的覆盖率均在99.99 %以上，覆盖率数值越高，样本中序列被测出的概率就越高，表明测序结果代表了样本中微生物的真实情况。Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的生物多样性，常用的度量标准Chao指数和Ace指数越大则表示菌群的丰度会越高，Simpson指数越小而Shannon指数越大，说明样品中群落的多样性会越高。由表1可知J样品的丰度小于JC样品，而群落多样性高于JC样品。

表1 J及JC样品多样性指数统计表Tab.1 Alpha-diversity statistics of J and JC

2.2.2 Venn图分析

图1比较直观地表现了样本相似水平为97%时OTU数目组成的相似性及重叠情况。J样品OTU数目为13，JC样品为17，而它们共有的OTU数目为11，重叠度较高，说明样品鸡蛋腐败变质表现形式不同(蛋白液化或鸡蛋发臭)。虽然污染细菌的种类具有较大的相似性，但也存在一定的差异，具体为：在共有的OTU14[吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobactergillenii)]、OTU23、OTU11[沙雷氏菌(Serratia)]、OTU27、OTU3 [假单胞菌(Pseudomonas)]中，JC样品的丰度大于J样品，占85%以上，JC样品另外含有少量的OTU5 [肉杆菌属(Carnobacterium)]、OTU24 [大肠杆菌志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)]等，而J样品大部分为特有的OTU10 [芽孢杆菌(Bacillus)]、OTU8、OTU9、OTU7 [肉杆菌属(Carnobacterium)]，所占比例90%以上。

图1 J及JC样品OTU水平Venn图Fig.1 Venn diagram of J and JC on OTU

2.3 样品物种组成分析

2.3.1 门、科水平物种组成分析

如图2所示，在科水平上两个样品覆盖14个科，J样品的芽孢杆菌科(Bacillaceae)相对丰度最大为40.13%，其次是莫拉克斯氏菌科(Moraxellaceae)为39.21%，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为20.20%，将平均丰度低于0.1%的部分合并为其它，则其它的丰度仅为0.16%。而JC样品相对丰度最大的是变形菌门的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为86.69%，假单胞菌科(Pseudomonas)为12.54%，其它的相对丰度总和为0.13%，其中包括所占比例较大的厚壁菌门肉杆菌科序列数为137。从图2渐变的颜色可知，JC样品种群比J样品丰富。

图2 J及JC样品科水平物种热图Fig.2 Heat map analysis on family level of J and JC

2.3.2 属水平物种组成分析

样品细菌群落结构在属水平上的序列数和相对丰度见表2。表2直观地表现出两样品同一菌属的丰度具有一定的相似性与差异性。

表2 J及JC样品属水平物种组成Tab.2 Community analysis on genus level of J and JC

在J样品中前四位高丰度值的是芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)，而在JC样品中主要是柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，其次为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、肉食杆菌属(Carnobacterium)。这说明不同种属细菌代谢特点导致鸡蛋在腐败过程中发生特殊的生化反应，表现出蛋白液化或明显臭气味的变质现象。尽管埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)和肠球菌属(Enterococcus)等序列极少丰度很低，但也不能排除其对鸡蛋腐败变质的影响。另外，JC样品中大部分为柠檬杆菌属细菌，其丰度达81.23%，其他种群丰度小种类多，共有6个属比J样品丰富。

3.3.3 种水平物种组成分析

种水平物种组成分析结果见表3。由表3可知，两个样品在种水平上共覆盖了23个种，其中主要为吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobactergillenii)、未分类芽孢杆菌(unclassifiedBacillus)、未分类不动杆菌(unclassifiedAcinetobacter)、未分类假单胞菌(unclassifiedPseudomonas)、未分类沙雷氏菌(unclassifiedSerratia)和肠道细菌肉杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum)。

在23个种中有14个种为未分类或未培养的种群，同一个未分类的种又分属于不同的OTU，如未分类不动杆菌分属于OTU8、OTU28、OTU9，未分类沙雷氏菌分属于OTU23和OTU11。每个OTU对应于一个不同的16S rRNA序列，即每个OTU是对应于一个不同的细菌(微生物)种的。由此说明，样品中的不动杆菌和沙雷氏菌分别在种以下有细分的分类单元，如亚种、型，需要在后续研究中通过单菌株的生理生化试验和16S rRNA序列测序加以鉴定和分析其生物学特性。

表3 J和JC样品种水平物种组成Tab.3 Community analysis on specise level of J and JC

3 讨论

本研究结果发现变质鸡蛋内容物中的主要菌群为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和莫拉菌科(Moraxellaceae)不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)细菌以及厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌科(Bacillaceae)芽孢杆菌属(Bacillus)和肉杆菌科(Carnobacteriaceae)肉杆菌属(Carnobacterium)的细菌。

柠檬酸杆菌属(Citrobacter)是动物及人类肠道内正常的肠杆菌科菌群之一，其成员原来分别被包含在沙门氏菌属(Salmonella)和埃希氏菌属(Escherichia)中，1953年开始列为独立的菌类，后改为属[6]。最早只有弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfleundii)1个种，1993年，通过DNA分子杂交试验，分为11个种。柠檬酸杆菌是条件致病菌，其中弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfleundii)是一种典型的导致人-畜-鱼共患病的条件性致病菌，适当条件下可引起人类发生腹泻、食物中毒和继发感染等一系列疾病[7-9]。有研究报道，弗氏柠檬酸杆菌引起动物和人感染时有携带如β-内酰胺酶等新型耐药基因的可能，且发现有cfa、ST和SLT等多种毒力因子[10]。研究发现，柠檬酸杆菌能分解食品中的营养物质，生成胺、硫化物、醇、醛、酮和有机酸等具有不良风味的代谢产物，最终导致食品变质[11]。Brenner等[12]研究发现吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobactergillenii)与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfleundii)的相关度较近。同属于肠杆菌科的沙雷氏菌属(Serratia)包括粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、深红沙雷氏菌(Serratiarubidaea)、普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)、臭味沙雷氏菌(Serratiaodorifera)、无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)等多个种，其中与人类有关的为粘质沙雷氏菌、深红沙雷氏菌和液化沙雷氏菌，可引起人体疾病如呼吸道、泌尿道感染以及败血症。沙雷氏菌可在动植物食品中生长繁殖，陈历水等[13]从保质期内出现腐败、胀包的低温肉制品中分离得到1种产耐高温蛋白酶的沙雷氏菌属细菌，说明沙雷氏菌对肉制品和其他富含蛋白质食品的腐败变质有一定影响。本文样品中沙雷氏菌属占居的相对丰度较小，是否对高蛋白质的鸡蛋内容物腐败造成影响有待进一步研究。近年来，有大量文献报道莫拉菌科不动杆菌属细菌是肉类食品中重要的腐败菌[14-16]，他们具有较强的蛋白酶活力及产生TVB-N的能力，污染食品后，能大量生长繁殖并水解食品中的蛋白质，使其失去原有风味；并且可利用氨基酸作为生长基质，产生酯、酸等物质。因此本研究中不动杆菌可能是导致鸡蛋腐败变质的主要菌群之一。到目前为止，已确认的假单胞菌共有29种，其中铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌等引起食品中的蛋白质和脂肪等营养物质分解后，使食品出现臭味、苦味、腐败味、脂肪氧化味或老化产生胶凝等一系列食品品质问题。这些品质变化说明，荧光假单胞菌明显缩短一些富含蛋白质和脂肪食品的保质期，从而导致经济损失[17-19]。更有研究表明[20]，假单胞菌是导致冰鲜鸡肉腐败优势菌群之一，可导致蛋白质分解，加速肉品腐败变质，产生一些带有异味的物质，如含硫化合物、酯、酸等。蛋白质是鸡蛋的主要成分之一。由于芽孢杆菌属细菌具有抗逆能力强、耐高温、易贮存等生物学特性，而且可以产生一些抗菌物质，因此得到了广泛的研究和应用[21-23]。然而芽孢杆菌酶系丰富代谢能力强的特点，也是食品腐败菌的原因。研究发现肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)、脂肪酸芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等可以导致肉类食品[24,25]、果汁饮料[26]以及豆类食品的腐败变质[27]。本研究J样品的芽孢杆菌科相对丰度达40.13%，JC样品中几乎为零，因此认为芽孢杆菌可能是导致鸡蛋腐败变质产生臭味气体的主要腐败菌之一。

赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、噬氢胞菌属(Hydrogenophaga)、肠球菌属(Enterococcus)、固氮弧菌属(Azovibrio)、埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、弓形杆菌属(Arcobacter)、陶厄氏菌属(Thauera)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氮副球菌属(Stenotrophomonas)、代尔夫特菌属(Delftia)、气单胞菌属(Aeromonas)、变形杆菌属(Proteus)这几种菌属在鸡蛋菌群中占的相对丰度不大，但是并不说明这几种菌属对鸡蛋变质没有影响。研究报道[28-30]，这些菌属中的肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、变形杆菌属(Proteus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、固氮弧菌属(Azovibrio)等都有致腐能力，所以导致鸡蛋腐败变质的主要腐败菌并一定不是占相对丰度大的优势菌属，也有可能是相对丰度较小但致腐能力强的菌属。

高通量测序是不依赖于微生物纯培养的分子生物学方法，能在短时间内产生大量的数据，已广泛地应用于微生物生态研究。本文研究变质鸡蛋内容物细菌种群多样性，发现样品中细菌种群丰富，主要的是肠杆菌科、芽孢杆菌科、莫拉菌科以及假单胞菌科的细菌，没有发现鸡蛋传播传染病病原沙门氏菌、弯曲杆菌以及李斯特氏菌，但是有一部分种群属于分类不明确的“unclassified”。从属水平分析，研究结果表明样品中柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度最高，同时也存在相对丰度极低但可能对鸡蛋品质造成影响的其它类群，如葡萄球菌属、埃希氏菌属、肉食杆菌属、弓形杆菌属细菌等。从种水平分析，仅一部分序列能明确分类，其它有待进一步研究。