基于纳米金光学性质的分子检测与应用*

姚翠萍，王萌萌，王　晶，张镇西

（西安交通大学生命科学与技术学院生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西西安710049）

基于纳米金光学性质的分子检测与应用*

姚翠萍，王萌萌，王晶，张镇西*

（西安交通大学生命科学与技术学院生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西西安710049）

纳米金颗粒是近年研究最为广泛的纳米材料之一，它具有良好的生物相容性、化学稳定性以及独特的光学性质，在生物分子检测、诊断和治疗方面具有很大的发展潜力。尤其是纳米金显示出特殊的表面等离子体共振现象，导致了粒子表面产生强电磁场，并最终增强了诸如吸收和散射的辐射特性，其散射光强与粒子的尺寸和团聚状态有密切关系。而由于共振现象而产生的纳米金对光的强烈吸收并高效转换为热效应也被用于检测和治疗。此外，与纳米金尺寸相关的局域表面等离子体共振光学特性，能够在粒子附近产生很强的电磁场增强，从而构成表面增强拉曼散射的基础。纳米金在强光照射下也表现出良好的抗光漂白的荧光现象，其特有的荧光寿命也成为检测的一种有效手段。与其他荧光物质作用时，又表现出表面增强荧光特性以及荧光共振能量转移。综述中，在介绍纳米金这些特殊光学性质的基础上，回顾了其在生物分子检测方面的应用进展。

纳米金；光学性质；生物分子检测

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.001

0　引言

近几十年来，研究者们对于纳米材料不同于宏观物质的一些特性，例如表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应，进行了大量的研究。这四种效应所引起的纳米材料在力学、磁学、电学、热学及光学等方面的独特性能，已成为各个领域的研究热点。纳米金颗粒是近些年研究最为广泛的纳米材料之一，表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）是纳米金颗粒的一个重要性质。在SPR波长处激发纳米金颗粒，能够产生比在其他波长更强的吸收和散射［1］。纳米金颗粒的光学性质易受自身形状、大小、组成及颗粒间相互作用的影响，如纳米金团聚或分散时产生肉眼可见的颜色变化［2，3］。利用这些性质将纳米金颗粒制成生物探针，通过光谱技术测定光谱的变化来检测某种物质，已经成为一种生物检测的趋势。纳米金颗粒由于良好的生物相容性和化学稳定性、灵活的合成方法以及易于和抗体等生物分子结合的优点，在生物医学检测、诊断和治疗方面有较好的发展潜力［4］。

1　光学性质

当激光照射纳米金颗粒时，电磁场引发纳米金表面的导带自由电子振动，这个包围着粒子表面的电子震荡就会导致离子晶格中的电荷分离，形成沿着光电场方向的偶极子震荡。在一个特殊的频率上振幅达到最大，被称为表面等离子体共振。图1简单描述了球状纳米金颗粒表面等离子体振荡的产生过程。入射波电场引起纳米金颗粒自由传导电子的极化，净电荷差发生在颗粒表面，过剩的正电荷对邻近的负电荷产生库伦力作用，使邻近的负电荷向这个区域运动；然后该区域又出现过多的负电荷，由于电子间的相互排斥作用，电子又远离该区域运动，电子的起伏振荡发生在一个周期T内。

早在1908年，Mie等人通过求解光与球状颗粒相互作用的麦克斯韦方程，解释了单一孤立球状金属颗粒的表面等离子体共振性质［6］。通过Mie理论计算出的消光截面可由下式表示［7］:

图1　球状纳米金颗粒表面等离子共振激发示意图［5］Fig.1　Schematic diagram of surface plasmon resonance oscillation for a sphere

其中V为纳米颗粒体积，ω为激发光角频率，c为光速，εm和ε（ω）=ε1（ω）+Iε2（ω）为周围介质和颗粒介质的介电函数。当ε1（ω）=-2εm，ε2与εm无关时，满足共振条件。

根据理论分析可知，颗粒的尺寸及形状改变会引起表面电场密度的改变以及颗粒间的相互作用，导致SPR频率改变，从而影响颗粒的吸收和散射性质。而且，其粒子组成结构及其环境介质的介电常数也会对其产生影响，Halas等从实验证明了不同壳核比例的复合纳米颗粒的光学性质也不同［8］。

当纳米金受到强光照射时，会产生不易漂白的荧光特性［9］。此外，当纳米金与其他荧光物质之间的距离不同时，会出现荧光增强与荧光淬灭两个效应。人们能够利用这些性质，尤其是基于纳米金的荧光共振能量转移方法，对生物分子进行检测。等离子体散射的光频率与入射光相同，拉曼散射的光频率则与入射光不同。普通的拉曼散射信号较弱，在实际应用中有一定的局限性。通过将金属纳米颗粒作为基底，产生表面增强作用，可以使拉曼散射信号强度大幅提高。

1.1表面等离子体共振吸收

电磁场通过物质损失的能量由两部分组成:吸收和散射。由于非弹性过程，当光能被消耗时即为光吸收。在表面等离子体共振发生时，纳米金对光的吸收大幅增强，其程度相对于大多数有机染料分子提高5-6个数量级［4］。对于纳米金来说，可见光波长就可以满足共振条件，因此具有鲜艳的颜色［10］。

不同尺寸、不同形状的纳米金颗粒，颜色也不同。这是由于不同纳米金导带电子的SPR波长不同所致［11］。理论和实验证明纳米颗粒的尺寸和形态会对SPR吸收峰产生很大的影响。尺寸小于1～2 nm的金属颗粒，由于它们的能级是离散的，不会发生SPR现象，而会呈现出与尺寸有关的荧光性质［12］。块状材料（Bulk materials）在UV/Vis/IR区域有连续的吸收；而在纳米尺度内的金属颗粒，SPR波长会落在UV、Vis或IR的某一段区间，比如金纳米球的SPR波长在可见光范围内并且SPR波长随粒径变化的程度较小；壳核结构金纳米颗粒的SPR波长在近红外区域，改变颗粒尺寸或者壳核比例可在较大范围内调控SPR波长；对于金纳米棒，可对其纵横比进行调节，从而大幅度的改变SPR波长［4］。

另外，金纳米颗粒之间的相互作用也会对SPR波长造成影响。Sudhanshu等发现金纳米颗粒间距离变化了2.1 nm时，SPR波长移动了84 nm［13］。此时SPR波长发生改变是由颗粒间的表面等离子体耦合程度变化引起的。纳米金颗粒团聚时，颜色由红变紫或蓝，而且SPR带会变宽；相反，团聚的金纳米颗粒再次分散则颜色会由紫变红［14］，分别对应于SPR波长红移和蓝移。这种现象使纳米金在比色传感器方面受到很大的关注。Shipway等在实验中发现，在纳米微阵列中，随着金纳米颗粒层的叠加，在520 nm的吸收峰强度增大，且在650 nm处形成一个新的吸收带［15］。在纳米颗粒的组装或生长过程中，吸收峰强度和波长的增大表明纳米结构的尺寸变大。

强表面等离子体吸收性质使纳米金颗粒具有很好的光热效应。由于电子-声子和声子-声子过程，强吸收光能在皮秒范围内转化为热。所以，当激光照射在表面等离子体吸收带，纳米颗粒吸收光能并迅速转化为热能。如果纳米颗粒和生物分子，细胞或组织结合在一起，他们的热能会引起纳米颗粒周围局部区域的温度升高，导致蛋白失活，细胞膜通透性的改变或细胞死亡。对于组织，如果加热（照射）时间特别短，则热弹性膨胀造成的压力会导致空化气泡的产生。当一个体积被很快地加热时，就需要通过热膨胀产生的压力波来释放被加热的体积，从而产生光声效应。对空话气泡以及光声效应进行检测，可以测定特定的分子。

1.2散射

当光能在发射光子的物质中诱导产生电子振动时，就发生了光散射，散射光频率与入射光频率一致（瑞利散射）或者产生一个频移（拉曼散射）。频移对应于能量差导致的物质内部分子运动（分子旋转，拉伸或者振动）。由于SPR震荡，散射光也被增强，其程度与吸收类似，比大多数荧光分子的发射提高5-6个数量级［4］。

1.2.1等离子体共振散射

金属纳米颗粒在入射光照射下，颗粒表面的等离子体以与入射光相同的频率共振，并且发射同频率的电磁波，即在金属纳米颗粒表面发生了瑞利散射，也被称为等离子体散射（Plasmon scatter）［16］。

对于尺寸小于1/20波长的金属颗粒，可以用瑞利理论来计算散射光强度［17］。在图2的XYZ坐标系中，入射光（单色光）沿Z轴正方向传播且在Y轴方向振动，散射子位于坐标系原点处，r为空间检测位置与原点的距离，θ和α分别为原点与检测位置连线和Z轴正半轴、Y轴正半轴的夹角，φ为原点与检测位置连线在XY平面上的投影与X轴正半轴的夹角。

图2　计算等离子体散射光强度的照明和检测系统坐标系示意图［17］Fig.2　Coordinate system for describing the geometrical arrangement of the illuminating and detecting systems

若检测点在XZ平面上，那么检测点处的散射光强度IPERP为

式2和式3中，I0为入射光强度，λ0为入射光波长，α为球状散射子的半径，r为空间检测位置与原点的距离，nmed为散射子周围介质的折射率，m为与散射子成份相同的块状材料的折射率。由式3可看出，在θ=0°和180°的方向，散射光的强度最大，而在θ=90°和270°时，散射光强度为0。其他方向的散射光强度与cos2θ成正比。

若入射光为非偏振光，其他条件不变，那么在任意位置的等离子体散射光强度IU为

由以上三个式子可看出，改变介质折射率nmed、颗粒半径α以及入射波长λ0等条件，均可测得不同的散射光强度。另外，随着纳米金颗粒的尺寸增大，消光中等离子体散射的比例也在增加［18］。

EI-Sayed及其合作者用完全米氏散射研究发现，对于20 nm的纳米金，其总的消光系数几乎全部来自于吸收，当尺寸增加到40 nm，散射开始增加。当尺寸增加到80 nm时，吸收和散射对消光系数的作用相似。这是因为对于大于20 nm的粒子，高能级电子振动开始起主要作用，光吸收和散射被认为是多重振动［7］。以上研究可以指导生物医学应用中纳米金的选择，比如，对于成像，首选具有高的散射特性的大粒子，而对于热疗，由于光主要被小粒子吸收且被有效转换为热能而可以用于组织损伤，因此首选小粒子。

1.2.2表面增强拉曼散射

拉曼散射是一种非弹性散射，对不同的分子振动能级敏感，它能够提供目标分子特有的结构信息，因此拉曼光谱被称为物质的“指纹”。由于分子的拉曼截面积非常小（10-30～10-25/分子［19］），要产生可被测量的拉曼散射信号至少需要108个分子。因此，普通的拉曼光谱不适合分析物分子鉴定和高灵敏度检测。

在金属纳米颗粒或者表面粗糙的金属电极存在的情况下，拉曼散射信号强度可被大幅提高，这种现象被称为表面增强拉曼散射（Surface enhanced raman scattering，SERS）。SERS强度可以由下式表示［20］:

其中f2（λ0）和f2（λR）分别为激发波长和拉曼波长处的增强倍数，E为电磁场。SERS的增强机制有多种解释，目前普遍被接受的主要有两种:电磁场增强和化学增强。电磁场增强和化学增强均可用于分子与基底接触的情况，但是后者不能用于分子与基底不接触的情况。相比于电磁场增强，化学增强理论发展较为缓慢。化学增强被认为是分子吸附到金属基底上后，拉曼截面积相比于传统拉曼散射增大很多［21］。在化学增强模型中，电荷转移模型被普遍接受。当分子与基底接触后，会形成金属-分子的电荷转移。如果激发光能量和电荷转移的跃迁能级相同，金属-分子体系会产生共振电荷转移，从而产生SERS效应。

在电磁场增强机制中，拉曼散射信号的增强是由金属纳米颗粒表面的等离子体共振造成的而与分子性质无关。纳米颗粒的材质和颗粒间的耦合程度不同时，增强的效果也会有所不同［22］。当入射光的偏振方向平行于两纳米颗粒的连线时，金属纳米颗粒表面的电荷被极化，两表面上的电荷相互作用产生极大的电磁场，在这个区域散射信号的增强效果最好，称之为“热点”。Xu等在理论上研究了纳米颗粒的尺寸、入射波长、颗粒间距离对电磁场增强倍数的影响。在实验中测得SERS信号的最大增强倍数为1014，仅通过电磁场增强机制计算的增强倍数最大为1011，这说明SERS信号可能是由电磁场增强和化学增强共同达到的效果。

SERS效应可以由不同类型的金属纳米结构产生。例如，通过把纳米金胶体溶液进行沉积可以得到SERS效应［23］。但是，这种SERS基底合成的化学方法存在两个主要的缺点，第一，纳米粒子结构和SERS反应不可重复，第二，相关的LSPR不容易调节到激励波长。与此相反，纳米平板印刷技术可以很好的控制沉积到基底上粒子的尺寸和形状。从而可以对LSPR以及拉曼增强进行精确控制［24，25］。

SERS的重要性在于其表面选择性和高灵敏度，因此可以用来跟踪分子［26］。

1.3与纳米金相关的荧光特性

在临床诊断中，基于荧光的阵列和检测技术是灵敏度最高且最常用的生物检测之一。在强光照射下纳米金表现出极好的抗光漂白特性。在相对较高的激励能量状态下，除了量子产率低之外，纳米金呈现了很强的原生荧光［27］。He等采用柠檬酸钠法制备的纳米金，激励波长为514 nm和532 nm，在610nm波长左右获得荧光。他们检测的粒径从16 nm到55 nm，发现荧光强度随着纳米金颗粒的增大而增大。Abdelhalim等也对纳米金的荧光特性进行了研究［28］。他们购买了粒径分别为10 nm，20 nm以及50 nm的三个粒径的纳米金，采用荧光光谱仪进行扫描测量，发现当激励波长为308 nm时，纳米金在423 nm波长处获得荧光。他们的结果表明，随着纳米金尺寸的增加，荧光强度减小。当粒径为50 nm时，几乎测不到荧光，这与上述结果相矛盾。其原理可能是纳米金的荧光与其周围包裹的分子种类有关［29］。

分布于纳米金表面或者其溶胶附近的荧光物质，其荧光发射强度较之自由态荧光物质的发射强度大大增强，这就是表面增强荧光。美国Maryland大学的Lakowicz教授领导的实验室自1999年开始从理论和实验两个方面系统的研究了这一特殊的荧光现象，很快就获得了令人振奋的结果［30，31］。他们发现将荧光物种置于粗糙金属表面，可以增加该荧光物种的荧光量子产率，降低其荧光寿命，提高荧光物种的光学稳定性。当荧光物质与金属表面或者金属粒子距离为5 nm＜d＜20 nm时，荧光发射得到增强，增强机理主要有两种:1、由于表面等离子体共振使得局域电磁场增强从而使靠近基质或者粒子表面上的分子活化，激发效率提高，从而增强了荧光辐射强度；2、激发态的荧光物质回到基态过程中，辐射衰减速率值增大，从而增加荧光辐射强度［32］。

然而，当粗糙表面与荧光物质距离小于5 nm时，激发态的荧光物会以非辐射的形式将能量传递给基质并回到基态，表现为基质对荧光发射的猝灭效应。当荧光素与纳米金结合时，并且发射光谱与纳米金等离子共振谱带重叠时，就会发生共振能量转移，光漂白就会发生［33］。其辐射率和非辐射率都与粒子有关，已经证明小粒子的漂白效率更高［34］。当纳米金粒子被作为能量转移的受体时，这种效应称为纳米表面能量转移（Nanosurface energy transfer，NSET）。与FRET相比，NSET有两个优势:首先，其可测量距离更长一些，大约为2倍多；其次，同一个粒子可以淬灭从可见到近红外的不同发射频率的染料。因此人们对于小于2 nm的纳米粒子在生物纳米技术中的应用特别感兴趣［35］。漂白荧光素的另一个过程是光致电子转移（Photoinduced electon transfer，PET）到粒子上，这可以用金核的充放电模拟［36］。

荧光寿命是荧光测量中的一个重要参数，根据荧光寿命的不同即可获得不同分子和物质的信息。由于纳米金有特别短的荧光寿命（大约50飞秒）［37］，因此将纳米金与特殊分子结合可以用来检测特异性物质及分子。我们课题组通过特异性抗原抗体将纳米金连接到肿瘤细胞上，通过荧光寿命成像可以明确区分出正常细胞和肿瘤细胞［38］。其次，通过这种方法也可以进一步确认纳米金是否稳定地被结合到细胞上（未发表的数据）。

2　基于纳米金的生物分子检测

2.1比色法

当纳米金颗粒相互接近或解离时，SPR吸收带的位置会发生变化，这主要是由入射光引起的等离子体共振吸收造成的，利用这种性质进行分子检测的方法叫做比色法。比色法分为目视比色法和光电比色法。相比于光电比色法，目视比色法一般不需要借助于其它的检测仪器，能够直接通过肉眼观察反应前后颜色的变化。纳米金颗粒的团聚有两种作用机制，一种是粒子间交联机制，另一种是非交联机制［14］。

粒子间交联机制利用交联分子（Crosslinker molecules）和受体分子之间的结合克服排斥力，实现纳米金颗粒的团聚。这种方法通常需要将受体分子固定在纳米金颗粒表面。最为经典的例子是Mirkin小组首次研发的DNA探针，如图3所示［11］。将分别与目标DNA两端互补的两种DNA链连接到纳米金颗粒表面，制成两种纳米金探针。加入目标DNA后，DNA链的杂交使得纳米金颗粒团聚，溶液颜色呈现由红到紫的变化。团聚的纳米金颗粒再次被分散开时，溶液会呈现出与团聚时相反的颜色变化。Aslan等基于这种思路去检测葡萄糖［3］，以Con A（伴刀豆球蛋白-A）作为交联剂，使表面修饰有葡聚糖的纳米金颗粒团聚。加入葡萄糖后，葡萄糖占据Con A上所有的葡聚糖结合位点，团聚的纳米金颗粒分散开，溶液颜色由紫变为红色。类似的方法还被用于检测腺苷［2］、蛋白质［39］。这种方法也被用来检测各种金属离子，包括阳离子和重金属离子。在金属离子检测中，通常都需要在纳米金粒子表面结合螯合剂。当所检测的离子存在时，通过螯合配位体与螯合剂结合，就形成了多齿状粒子间复合物从而会导致纳米金的团聚。通过在纳米金表面修饰不同的化学基团，同样的方法也可以被用来检测阴离子［40］。

图3　纳米金表面的寡核苷酸相互杂交引起团聚的示意图［11］Fig.3　Schematic representation of the concept for generating aggregates signaling hybridization of nanoparticle-oligonucleotide conjugates with oligonucleotide target molecules

另外一种粒子间交联的思路是不再需要交联剂，将受体与目标分子分别修饰到纳米金颗粒上，两种类型的探针混合后出现团聚，或者使通过此方法团聚的颗粒再次分散［14］，通常会用到DNA的杂交或者裂解。非交联机制中，纳米金团聚是由范德华力主导的，原因包括两个方面:静电稳定性降低、空间稳定性降低。Wei等利用适配子与目标分子反应后构象变化诱导的纳米金颗粒团聚来检测α-凝血酶［41］。

2.2纳米金热效应应用

由于纳米金有很强的等离子体共振吸收效应，因此纳米金对一定波长的光具有强烈的吸收效应，而且可以高效转换为热。又由于纳米金粒径小，传热快，因此激光照射后所引起的损伤范围非常有限。这样根据纳米金的应用方式的不同，可以造成纳观，微观和宏观三个尺度的损伤，从而对不同层次的生物分子和组织进行操作。比如，宏观应用通常指组织主要是肿瘤的光热治疗，包括直接的光热消融［42］，光热作用提高药物的靶向及释放［43，44］，或者光热作用提高放疗的疗效等［45］；微观应用主要指对单个细胞的消融，脂质体的释放及药物的穿膜递送［46-48］等；纳观应用则包括对细胞膜纳米级穿孔［49］，DNA快速消融［50］，纳米金可控释放药物［51］，选择性蛋白质失活以及DNA等分子手术［52］等。近年来我们课题组在微观热效应和纳观热效应方面进行了一定的研究。利用纳米金的光热效应，我们对蛋白质进行了灭活［53］，并发现其热效应仅限制一个抗体，及大约15 nm范围内。在此基础上，我们将纳米金通过抗原抗体靶向到特异性细胞上，在控制包括纳米金的尺寸，纳米金的数量以及激光能量，脉宽等参数下，既可以使细胞膜产生暂时通透性，并不影响细胞活性［47，54］；也可以使细胞达到足够损伤从而造成死亡［55］。并且，我们通过不同的方法观测评估纳米金造成细胞膜损伤的范围，建立不同模型研究其机理。

通常，纳米金的成像技术一般都基于散射，辐射和吸收。而利用纳米金的光热效应也可以用来进行成像进而进行检测。当使用脉冲激光照射纳米金时，纳米金表面温度会升高，从而导致其周围局部的折射率发生变化并能被测量。这种技术可以用来观测单个细胞内纳米金的分布，从而可用于检测特异性的细胞［56］。

2.3等离子体散射应用

相比于等离子体共振吸收的研究热度，基于等离子体散射性质的传感器报道的较少。当入射光波长与SPR吸收波长相当时，不仅会有光的吸收，也会产生光的共振散射。越多的偶极子耦合，共振散射的强度越大。Kadir等搭建了一个简单的系统，如图4所示，通过检测纳米颗粒-Con A复合体结构变化引起的散射光变化来确定葡萄糖的浓度［57］。以白色LED做为光源照射样品，在与入射光呈90°的方向放置单色器检测散射光。分别测量560 nm和680 nm波长处散射光的强度，得到强度之比，就可得到葡萄糖的浓度。他们通过进一步的研究发现，这种基于散射光强度比率的检测方法不受纳米金颗粒的浓度和光源及单色器的波动漂移影响。Kadir等还利用散射光空间分布的变化来检测纳米金颗粒的团聚程度［28］。20 nm的纳米金胶体在523 nm和650 nm水平偏振激光照射下，它的散射光空间分布与cos2θ成正比关系（如式3所示），在链霉亲和素诱导下团聚时，散射光的空间分布不再遵循瑞利理论，而是大部分呈现出前向散射的现象。

图4　基于依赖波长的散射光比率的葡萄糖检测系统示意图［57］Fig.4　Experimental setup for wavelength-dependent ratiometric-scattering based glucose sensing

以上这些方法不受纳米金颗粒浓度的影响，这是动态光散射（Dynamic light scattering，DLS）和其它散射光技术所不具备的优点。传统的吸收光谱测量技术，需要在很大的波长范围内扫描，而基于纳米金散射光角度比率的方法，只需要获得某一波长的入射光在两个角度的散射光强度。此外，Wang等利用纳米金颗粒的等离子体共振散射检测尿液中的卡那霉素［58］。在加入可增强等离子体共振散射的尿素后，卡那霉素的浓度检测范围扩展到2～800 nmol/L。

由于不同形状尺寸的纳米金其共振散射峰值不同，采用白光对纳米金进行照射，在暗场显微镜下可以观察到不同形状和尺寸的纳米金发出不同颜色的光，即散射出不同波长的光。利用这个原理，让不同形状和尺寸的纳米金结合不同的配体，就可以同时检测多种不同的物质。

2.4SERS应用

纳米金颗粒具有强烈的表面等离子体共振特性，可大幅增强拉曼散射信号，因此纳米金被广泛应用于SERS光谱检测技术。Keipp等利用基于纳米金SERS效应的生物探针检测活细胞区域的局部PH值［59］。Qu等将氧化的Cyt c修饰到纳米金颗粒上，通过检测细胞内被还原的Cyt c的SERS光谱确定超氧阴离子基团的浓度，超氧阴离子基团的检测极限可达1.0×10-8mol/L［60］。最近，Kang等研发出一种金纳米球-线结构的SERS感应平台来检测多种病原体的DNA［61］。金纳米线和金纳米球上分别修饰有探针DNA和带有拉曼染料的报告DNA，加入目标DNA后，通过DNA链的杂交完成两种金纳米颗粒的自组装。这种球-线结构的SERS探针可检测的DNA浓度最低为10 pmol/L。Mirkin等分别用蛋白质配体及拉曼染料和抗体及拉曼染料修饰纳米金颗粒，在蛋白质微阵列上实现蛋白质-小分子和蛋白质-蛋白质相互作用的多元筛选［62］。Wang等利用抗原-抗体之间的相互作用使得两种不同形态纳米金颗粒进行可控的组装，结合SERS光谱检测特定的蛋白质［63］。将抗体片段及拉曼活性染料分别修饰到金纳米球和金纳米棒上，得到两种SERS纳米颗粒。在加入靶蛋白后，纳米颗粒会组装成图5中所示的形态，颗粒表面的等离子体相互耦合从而增强拉曼散射信号。此外，基于SERS的金纳米探针还被用于凝血酶［64，65］、蛋白酶［66］和碱性磷酸酶［67］等蛋白质的测定。

2.5有关荧光性质的应用

将荧光物种置于粗糙金属表面或超薄光滑金属表面，使荧光物种的荧光发射性能获得极大的改善［68，69］。这个特殊的性质使其在DNA无损检测中得到广泛应用。DNA分子的每个核苷酸残基均包含一个具有紫外吸收的碱基，但实际上所观测到的DNA分子荧光非常弱［70，71］，寿命也非常短（约10 ps）。将DNA分子置于粗糙金属表面上，就有可能提高DNA分子的荧光强度，达到直接测定DNA分子的目的。与传统的DNA分子检测用标记或探针技术不同，利用这一新技术可以实现对DNA分子的直接测定，不再需要引入外来物质，真正实现非破坏性检测。

基于纳米金的荧光共振能量转移经常被用于检测DNA、一些小分子和金属离子。DNA特殊序列的检测在临床诊断，食品和药品工业，以及病理、遗传和环境的检测中都起到了举足轻重的作用。目前人们发展出通过用纳米金标记分子的基于发夹FRET系统的DNA检测系统。如图所示［72］:

核酸传感器与有机染料结合并互补，在纳米金上形成发夹结构，由于FRET效应，荧光被淬灭。当DNA与目标DNA进行互补杂交时，发夹结构变化为棒状结构，染料的荧光就会增加。使用相似的原理，Nie等人证明末端带有荧光素的单链核酸功能化的纳米金可以组装为受限的拱形结构。在这个结构中，由于供体和受体的距离接近荧光素被纳米金有效淬灭。当与目标DNA连接时，受限的拱形结构被打开，荧光素从纳米颗粒上分离，重新获得荧光。这种方法被用来检测使用核酸酶后DNA的断裂［35］。利用相似的原理，Mirkin等人还发展出用于检测和定量分析细胞内物质的纳米金传感器，比如，细胞内的mRNA［73］。Bai等人设计出基于纳米金的FRET系统识别由G-四联体稳定的有机分子［74］。Fan等人报道了基于多色荧光纳米金的分子标记来检测目标分子的系统［75］。

图5　基于通过抗原-抗体夹心装配的纳米金表面等离子体耦合增强（用粉色标出）的SERS免疫检测示意图［63］Fig.5　Single-step SERS immunoassay based on plasmonic coupling enhancement（highlighted as pink corona）via sandwiched antibody-antigen assembly

图6　染料-寡核苷酸-纳米金结合体在与目标DNA杂交前后的构象变化Fig.6　Schematic illustration of DNA detection，showing the conformational changes of dye-oligonucleotide-AuNP conjugates before and after hybridization with the target DNA

基于纳米金的FRET系统还可以用来检测金属离子和小分子。Murray及其合作者报道了基于FRET来检测不同金属离子的系统［76］。带负电的硫普罗宁包裹的纳米金与阳离子荧光素［Ru（bpy）3］3+通过静电结合导致荧光淬灭。当把复合物加入电解液中时就会解离，从而荧光素的荧光恢复。目前这种方法已经被用于检测Hg2+离子［77］。Chang等人报道了最优化的罗丹明B吸附的纳米金系统对汞二价离子的选择性比其他离子（Pb2+，Cd2+Co2 +）高50倍。Zhu及其合作者发展出采用二吡啶基苝桥纳米金的基于FRET的铜离子传感器［78］。最初纳米金上的二吡啶基苝的荧光被淬灭，当铜离子存在时，铜离子代替了纳米金上的二吡啶基苝，从而荧光恢复。

除了用于检测金属离子外，基于纳米金的FRET系统还被用于检测有机小分子。Chang等人将尼罗红非共价地结合在纳米金粒子上用于检测亚微摩尔水平的硫醇［79］。此外，Tang等人设计了一种基于FRET的胆固醇传感器，其中使用的是β环糊精功能化的纳米金［80］。纳米金上的环糊精腔内含有荧光素，由于FRET效应，荧光被淬灭。当存在胆固醇时，由于其具有更高的亲和力，环糊精内部的荧光素被胆固醇代替，从而荧光素的荧光恢复。这种方法可以检测到纳摩水平的胆固醇。

此外，由于小于1.2 nm的纳米金本身具有很强的荧光特性，因此可以利用由于聚集而导致的荧光淬灭或者纳米金的荧光增强来检测金属离子和蛋白质［81］。

4　总结

独特的光学性质、良好的生物相容性和化学稳定性、灵活的合成方法，是纳米金应用于生物分子检测的优势。通过控制其形状及尺寸，可以得到不同的光学性质，比如SPR最大吸收峰位置，这在设计生物探针时可以为研究者提供较大的选择范围。基于比色法的纳米金探针已经被用于检测核酸、蛋白质、小分子及金属离子，在临床诊断、药物递送等领域有很大的发展潜力。目前一些已经被用于检测的纳米金比色反应许多都是以纸质做基底，例如早早孕检测试纸，这为人们提供了一种便宜、低样品量、一次性的便捷生物医学检测方式［14］。采用比色法的探针检测极限通常在毫摩尔到几十纳摩尔之间。基于纳米金等离子体散射的检测方法虽然报道的不是很多，但是它具有灵敏度高、易操作等特点，已经被用于检测氨基酸、生物分子和有机小分子［82］。纳米金自身具有优良的光学性质，是SERS检测中理想的基底材料。这种表面光谱技术可在分子水平上研究物质的结构信息，已在表面科学、材料科学和生命科学中发挥着日益重要的作用。相对于其他两种检测方法，SERS应用更广，而且灵敏度也很高，甚至能达到皮摩尔。而基于纳米金有关的荧光性质中，FRET是应用最多的一种方法。主要用于检测DNA，金属离子等，但是其最高检测浓度也是达到纳摩水平。综上所述，SERS目前是检测灵敏度最高的一种方法，但是其仪器相对比较昂贵。比色法是最简单的一种方法，对于精度要求不高的检测，可以直接使用。纳米金探针结合各种光谱技术在未来的生物检测和医学检测中拥有巨大的发展潜力，将会提供更多更简单快捷、更便宜、更精准的检测方式。

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Gold Nanoparticles:Optical Properties and Implementations in Molecular Detection

YAO Cuiping，WANG Mengmeng，WANG Jing，ZHANG Zhenxi*
（Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，the School of Life Science and Technology，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，Shanxi，China）

Gold nanoparticles are one of the most widely studied nanoscale materials in recent years.It has great potential applications in area of bimolecular detection，diagnosis and therapy，due to their unique optical properties，facile surface chemistry，excellent biocompability and chemical stability.Especially，gold nanoparticles exhibit a unique phenomenon:strong surface plasmon resonance that lead to strong electromagnetic fields on the particle surface and consequently enhances all the radiative properties such as absorption and scattering.The scattering light intensity is extremely sensitive to the size and aggregation state of the particles，and the efficient conversion from light into heat by these gold nanoparticles can also be used for detection and therapy.Additionally，the main parameter of size-dependant optical properties of gold nanoparticles is the localized surface plasmon resonance（LSPR）known to generate a strong local enhancement of the electromagnetic field at the vicinity of the nanoparticles，this phenomenon is the basis of the surface enhanced Raman scattering.Furthermore，gold nanoparticles show excellent behavior of anti-photobleaching under the

presence of strong light illumination，its fluorescence lifetime imaging can be used to detect such as cancer cells using molecularly targeted gold nanoparticles.Gold nanoparticle-based enhancement fluorescence emission and fluorescience resonance energy transfer were also discussed.In this review，we cover these important optical properties of gold nanoparticels and address their recent application on bioprobe.

gold nanoparticles；optical properties；bio-molecule detection

TB383；O657.3

A

1007-7146（2015）04-0303-11

2015-05-11；

2015-06-12

国家自然科学基金项目（61108079，61120106013）；西安交通大学基本科研业务费（xjj2012133）资助

姚翠萍，博士，博士生导师，研究方向为生物医学工程和生物医学光子学。（电子邮箱）zsycp@mail.xjtu. edu.cn

（电子邮箱）zxzhang@mail.xjtu.edu.cn