漫反射光谱测量皮窗模型中血管的血氧饱和度*

李艺容，林黎升，刘丽娜，陈德福，，顾 瑛，李步洪*

（1.医学光电信息科学与技术教育部重点实验室，福建省光子技术重点实验室，福建福州350007；2.中国人民解放军总医院激光医学科，北京100853）

漫反射光谱测量皮窗模型中血管的血氧饱和度*

李艺容1，林黎升1，刘丽娜1，陈德福1，2，顾 瑛2，李步洪1*

（1.医学光电信息科学与技术教育部重点实验室，福建省光子技术重点实验室，福建福州350007；2.中国人民解放军总医院激光医学科，北京100853）

血管中的血氧饱和度（Oxygen saturation，StO2）作为影响血管靶向光动力疗法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）疗效的关键要素之一，实验测量了活体裸鼠背皮窗模型中血管的漫反射光谱（450-800 nm），并通过拟合漫反射光谱数据定量获得了血管中的StO2。同时，研究了高氧、低氧和常氧等三种不同氧条件下V-PDT中血管的StO2和血管管径的变化情况。结果表明，高氧和常氧条件下的平均StO2和血管收缩较为显著，但低氧组的平均StO2和血管收缩不明显。在相同氧条件和不同光照功率密度条件下，V-PDT前后靶向血管的平均StO2与血管管径的变化之间没有显著相关性，但V-PDT前后平均StO2的变化量与光照功率密度之间呈正相关。

血管靶向光动力疗法；皮窗模型；漫反射光谱；血氧饱和度；血管收缩率

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.003

血管靶向光动力疗法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）是一种联合利用光、光敏剂和氧分子，通过一系列光物理化学反应消耗氧分子［1］，产生单线态氧（1O2）等活性氧物质并引起血管损伤的靶向疗法。V-PDT已广泛应用于选择性治疗血管性疾病，如前列腺肿瘤、鲜红斑痣和老年性黄斑变性等［2］。在V-PDT过程中，氧的消耗会造成靶向血管中氧分子的减少，从而可能降低活性氧物质的产量，进而影响V-PDT的疗效［3］。与此同时，血液中氧含量变化还将改变组织的光学特性，影响V-PDT的治疗深度和治疗效果［4］。因此，监测V-PDT中靶向血管内的氧含量对于实时优化和调整的治疗方案，提高疗效具有重要的意义。

研究表明可以采用核磁共振［5］、频域光子迁移光谱［6］和傅里叶变换光谱成像［7］、光声显微成像［8］、多光谱成像［9］以及反射光谱［10］等技术测量血液中的氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的浓度并计算获得组织中的StO2，从而间接地获得组织中的氧含量。与其它技术相比，漫反射光谱技术通过便携式光谱仪实现数据采集，测量装置相对简单，具有无损、快速、可重复和高性价比等优点而在临床上得到了初步的应用。Wang等人利用漫反射光谱研究了PDT前后C3H小鼠中RIF肿瘤的StO2相对变化量，并发现StO2相对变化量与PDT疗效之间呈正相关性［11］。Woodhams等人利用可见光反射光谱实验研究了组织坏死程度与StO2的关联性，保持相同治疗光剂量，当激光功率密度较低时，被测组织StO2减少缓慢且变化量越小，但组织坏死程度越高［12］。此外，王颖等使用漫反射光谱技术临床监测V-PDT治疗鲜红斑痣过程中氧含量的变化，通过观察漫反射光谱特征变化来反应不同颜色病变组织StO2的变化情况［13］。上述研究表明漫反射光谱技术可用于组织StO2的检测，但尚未见活体鼠背皮窗模型中血管的StO2的漫反射光谱检测以及StO2与血管形态变化关系的研究报道。

本文首先验证了漫反射光谱技术检测鼠背皮窗内血管StO2的可行性，分别获得了鼠背皮窗模型中血管在V-PDT前后StO2的变化关系。其次，研究了不同氧条件对V-PDT血管管径变化的影响，并分析在相同治疗光剂量条件下，StO2的变化量与激光光照功率密度和血管管径变化之间的关系。

1　材料与方法

1.1化学药物

采用光敏剂玫瑰红（Rose bengal，RB）（Sigma-Aldrich.，St.Louis，USA）开展V-PDT实验。将RB溶于生理盐水制备成浓度为12.5 g/mL的储存液，放置于4℃避光环境中备用。实验时将储存液稀释至所需给药剂量浓度，光敏剂溶液制备在暗室条件下完成。

1.2裸鼠脊背皮窗模型

实验采用年龄大约10-12周，体重为25-30 g的雄性BALB/c裸鼠（Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.Ltd.，Shanghai，China）建立裸鼠脊背皮窗模型［14］。按每公斤体制80～90 mg/kg的剂量将戊巴比妥钠溶液（北京化学试剂公司）经腹腔注射使裸鼠处于麻醉的状态后，通过手术在裸鼠背部缝合安装钛合金皮窗（SM100，APJ Trading Co.，Ventura，USA），在鼠背皮窗一侧去除一层直径为10 mm区域的皮层，之后将圆形玻璃盖玻片放置于皮层去除区域，该模型可全视窗直接观察表皮和皮下血管。

1.3V-PDT实验

裸鼠经戊巴比妥钠溶液麻醉后，通过尾缘静脉注射RB溶液（给药剂量25 mg/kg）后立即进行VPDT照光。所用的治疗光源为532 nm半导体激光器（Changchun new industries optoelectronics technology Co.，Ltd.，China），经光纤（R400-7-UV-VIS，ocean optics Inc.，USA）耦合后均匀地辐射靶向区域。VPDT过程中将裸鼠放置于加热垫上以确保其体温维持正常（33-34℃）［16］。为了消除测试过程中外界环境和动物的抖动带来的影响，所有的测试均在黑暗的环境中且在固定的操作台上进行。

18只鼠背皮窗模型随机分成三组开展不同氧条件的V-PDT实验，分为高氧组、低氧组和常氧组（n= 6）。高氧组裸鼠在V-PDT过程中吸入Carbogen气体（95%O2和5%CO2），低氧组裸鼠吸入氮氧混合气体（92%N2和8%O2），常氧组则正常呼吸空气。实验采用光功率密度100 mW/cm2进行照光，照光时间为300 s，每次V-PDT治疗的光剂量均为30 J/cm2。在常氧组中还开展了不同光照功率密度的V-PDT对照实验。在上述100 mW/cm2（n=6）光照实验组的基础上，增设了50 mW/cm2（n=6）和200 mW/cm2（n=7）光照实验组，对应的照光时间分别为600和150 s。同时还增加了1个无光敏剂无光照的空白对照组（n=2）和3个无光敏剂有光照的光照对照组（50 mW/cm2（n=2），100 mW/cm2（n=2）和200 mW/cm2（n=2））。

1.4白光图像采集

实验采用徕卡体式显微镜（Leica MZ 16FA，Wetztar，Germany）分别在V-PDT前后对靶向区域的血管进行8×观察并采集鼠背皮窗的白光图像。

1.5漫反射光谱测量

利用自行研发漫反射光谱系统在V-PDT治疗前后分别对靶向区域进行漫反射光谱数据采集［17］。漫反射光谱系统由卤素灯（HL-2000-HP，Ocean Optics Inc.，USA），传输和收集光的Y型光纤（200 μm core diameter，NA=0.22，Ocean Optics Inc.）以及微型光纤光谱仪（QE65000，Ocean Optics Inc.，USA）组成。

首先采集暗背景光谱和卤素灯光源的参考光谱，参考光谱测量利用漫反射标准白板（WS-1，Ocean Optics Inc.）反射率＞95%，获得卤素灯光源的参考光谱并存储。然后将QE65000微型光谱仪测量模式设置为漫反射光谱测量模式。测量时在所有的皮窗模型中，V-PDT前后分别选取3个感兴趣区域（ROI）进行漫反射光谱数据采集（波长范围为450-800 nm），对每一个采集区域进行三次测量。测量过程中光纤探头与血管保持垂直测量的角度且紧贴于血管。最后，对所测量的漫反射光谱进行拟合，获得靶向区域血管中的StO2。

1.6血管中的StO2

血管中的StO2取决于血管内氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的浓度，其特征值表示为式（1）: CHbO2和CHb分别表示氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的浓度［18］。

对扣除暗背景和标准白板反射谱后的漫反射光谱根据式（2）进行拟合计算获得［19］。

其中C是反射信号的振幅，ρ是相对血液体积分数，μαHbO2血液中完全含氧的吸收系数，μαHb（λ）血液中完全缺氧的吸收系数。其中平均StO2变化量指的是单个皮窗模型中各个采集区域V-PDT前与V-PDT后StO2的变化量取平均。

此外，利用Leica Qwin软件（version 3.2.0，Leica，Cambridge，UK）定量分析鼠背皮窗血管白光图像获得血管管径的变化，其中血管收缩率可定义为［20］:

其中，Dbefore和Dafter分别表示V-PDT前后靶向血管的管径。

2　结果与讨论

2.1白光图像和漫反射光谱

图1（a）和（b）分别给出了辐射光功率密度为100 mW/cm2的V-PDT前后鼠背皮窗的白光图像，其中黑色圆圈ROI-1，ROI-2和ROI-3为StO2的测量位置。V-PDT后靶向区域血管出现局部收缩，血管管径减小。图1（c）和（d）中三条曲线分别对应的是VPDT前和V-PDT后血管ROI-1，ROI-2和ROI-3的漫反射光谱和拟合曲线，V-PDT前后血管的漫反射光谱形状发生了显著变化，V-PDT前在542和577 nm处存在明显的吸收峰使得谱线呈现W型，而V-PDT后谱线则变为V型，这与王颖等人之前的测量结果一致［13］，V-PDT后血管中氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的相对浓度发生了变化。对V-PDT前和V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3漫反射光谱分别进行拟合获得相应的StO2。结果发现:V-PDT前ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分别为84.0%，77.8%和75.6%，测量结果与Wang等人利用光声成像技术测量的结果基本一致［8］，即静脉StO2为70%～75%，动脉StO2为90%以上，动静脉平均StO2为80%～82.5%。实验表明，利用漫反射光谱技术测量鼠背皮窗中的血管漫反射光谱，通过数学拟合光谱数据间接获得靶向区域的StO2方法可行，客观，准确，为以鼠背皮窗为模型的相关血氧检测实验研究提供了实验依据。V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分别为16.4%、11.7%、31.3%，与V-PDT前相比各个靶向区域的StO2均有显著下降，这是由于氧的光化学消耗以及光动力效应导致血管的封闭引起的［21］。

2.2血管经V-PDT后的平均StO2和血管管径的变化

图1　皮窗中血管在V-PDT（a）前和（b）后的白光图像以及对应ROIs在V-PDT（c）前和（d）后的漫反射光谱Fig.1　Stereomicroscope images of blood vessels in the entire dorsal window chamber（a）before and（b）after V-PDT，and the corresponding diffuse reflection spectra of ROIs（c）before and（d）after V-PDT

表1　不同氧条件下血管经V-PDT后的平均StO2和血管管径变化Tab.1　The average StO2and diameter for the blood vessel before and after V-PDT when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions

从表1可以发现，V-PDT前高氧组血管的平均StO2显著高于常氧组（P＜0.001），而低氧组的平均StO2则显著低于常氧组（P＜0.001）。V-PDT前后相比高氧组和常氧组的平均StO2均有显著降低（P＜0.001），对应的靶向区域的平均血管管径显著减少（P＜0.001），而与低氧组V-PDT前后相比，平均StO2和平均血管管径虽有减少，但差异不显著（P＞0.05）。

图2给出了低氧，高氧和常氧三种不同氧条件下对应的平均血管收缩率情况。由图2可知高氧组和常氧组的平均血管收缩率较高，且两组平均血管收缩率无显著差别（P＞0.05），而低氧组的平均血管收缩率较小（P＜0.001）。我们小组之前的研究表面RB溶液在高氧和常氧组氧条件下1O2的发光强度之间无明显差异，而在低氧条件下，1O2发光强度较小［22］，这与我们的平均血管收缩率的变化相一致，表明V-PDT过程中1O2在低氧条件下产量降低，导致血管收缩不明显。

图2　不同氧条件下血管经V-PDT后的平均血管收缩率Fig.2　Theaverage vasoconstrictionsof blood vessels after V-PDT under hypoxic，normoxic and hyperoxic conditions

分析比较实验组和对照组V-PDT前后血管管径和StO2变化情况，发现大部分实验组ROI出现不同程度的收缩现象，相应的血管StO2均出现不同程度的下降。实验组的19只裸鼠中有13只（50 mW/cm2实验组5只，100和200 mW/cm2实验组各4只）裸鼠血管出现显著收缩，其平均血管收缩率为56%± 15%。有5只裸鼠（50 mW/cm2实验组1只，100 mW/cm2实验组1只以及200 mW/cm2实验组3只）V-PDT后血管出现轻微收缩，其平均血管收缩率为2 %±1%。另有100 mW/cm2实验组1只裸鼠出现血管轻微扩张，管径增大，但其对应的StO2在V-PDT后也有所下降。不同激光功率密度下，平均血管收缩率与平均StO2变化量之间没有显著的关联性。此外，空白对照组和光照对照组均无观察到血管收缩或者扩张现象，且StO2也未改变。这说明仅有光热效应不会对血管造成实质性的损伤，对氧含量的变化亦不会产生影响，表明V-PDT在一定剂量的光、光敏剂和氧分子共同作用下，血管内皮细胞的损伤和血小板黏附可引起血管局部收缩［23］。

图3对实验组鼠背皮窗靶向区域血管的StO2数据进行分析，从图3我们可以清楚地看到平均StO2变化量与激光功率密度在标准的范围内呈现出线性关系（R2=0.9297）。图中的误差是由于裸鼠个体间差异性导致。随着辐射光功率密度的增加结果StO2变化越大，两者是成正相关的关系。在较高功率密度下StO2减少速度快且减少量大。相反，在低光功率密度时，StO2减少缓慢且变化量小。V-PDT对照组的StO2前后没有显著变化。由于三个功率密度的照光时间分别为600 s，300 s和150 s，所以较高功率密度下StO2消耗速度快，这与通过吸收光谱技术测量溶液［24］或者肿瘤［18］模型下的实验结论一致，随着激光功率密度增大，PDT过程StO2变化得越大且消耗得越快。

图3　平均StO2相对变化量与光照功率密度之间的关系Fig.3　The V-PDT induced change in StO2was positively correlated with various irradiances

3　结论

光动力反应导致氧含量的消耗是影响V-PDT疗效的一个关键因素，因此监测StO2的变化以实时调整V-PDT治疗方案有助于提高V-PDT的疗效。我们验证了利用漫反射光谱技术检测皮窗模型中血管StO2具有可行性。在不同氧条件V-PDT下裸鼠皮窗模型中靶向血管的StO2和血管管径变化情况不同。高氧组和常氧组的平均StO2减少和平均血管收缩均较为显著，而低氧组的平均StO2减少和平均血管收缩不明显。此外，在相同氧条件不同功率密度V-PDT下，靶向血管的平均StO2均有显著减小，但其变化量与平均血管收缩率之间无显著的关联性。同时，光功率密度越大，靶向血管的StO2减少得越快且越多，平均StO2减少量与激光功率密度之间呈正相关。

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Measurement of Oxygen Saturation for Blood Vessels in Dorsal Window Chamber Using Diffuse Reflection Spectroscopy

LI Yirong1，LIN Lisheng1，LIU Lina1，CHEN Defu1，2，GU Ying2，LI Buhong1*
（1.Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Ministry of Education，Fujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology，Fujian Normal University，Fuzhou 350007，Fujian，China；2.Department of Laser Medicine，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Monitoring oxygen saturation changes during vasculartargeted photodynamic therapy（V-PDT）is crucial for achieving an optimal therapeutic outcome.In this study，the diffuse reflection spectra in the range from 450 to 800 nm were measured to quantitatively determine oxygen saturation（StO2）of blood vessels in dorsal skinfold window chamber. Furthermore，the changes of the average StO2and vasoconstriction of blood vessels in the region of interest（ROI）after V-PDT was evaluated when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions，respectively.The average StO2and vasoconstriction of blood vessels for normoxic and hyperoxic groups after VPDT was dramatically changed while no significant change was found for those of blood vessels in hypoxic group.No consistent pattern for the changes of StO2and vasoconstriction during V-PDT treatment can be observed.However，the V-PDT-induced change in StO2was positively correlated with various irradiances.

vascular targeted photodynamic therapy；dorsal window chamber；diffuse reflection spectroscopy；blood oxygenation saturation；vasoconstriction

Q631

A

1007-7146（2015）04-0320-06

2015-06-18；

2015-07-24

国家自然科学基金项目（61275216）；国家卫计委科学研究基金（WKJ-FJ-30）；福建省自然科学基金项目（2014J07008，2014J01225）

李艺容（1989-），男，硕士研究生，主要从事光动力疗法剂量学方面研究

李步洪（1973-），男，教授，博士生导师，主要从事生物医学光子学研究。（电话）0591-83465373；（电子邮箱）bhli@fjnu.edu.cn