微激光照射肥大细胞对胞内钙离子浓度的影响*

钟会清，杨　辉，周　艳，郭周义*，黄汉传，叶丙刚，倪艺榕，熊红莲，金 梅，吴秀丽，苏成康，龙 佳，林 锦

（1.华南师范大学生物光子学研究院，国家中医药管理局中医药与光子技术三级实验室，广东广州510631；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510623）

微激光照射肥大细胞对胞内钙离子浓度的影响*

钟会清1，杨辉2，周艳2，郭周义1*，黄汉传1，叶丙刚1，倪艺榕1，熊红莲1，金 梅1，吴秀丽1，苏成康1，龙 佳2，林 锦2

（1.华南师范大学生物光子学研究院，国家中医药管理局中医药与光子技术三级实验室，广东广州510631；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510623）

目的：研究850 nm波长微激光对肥大细胞照射后胞内钙离子浓度的影响。方法：实验前12 h，将肥大细胞接种于激光共聚焦专用培养皿中，然后用D-Hank's液洗涤3次，加入2 mL D-Hank's液，按照照射时间不同共分六组（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min），其中，空白对照组不进行激光照射处理；激光照射后，弃去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培养箱中孵育30 min后，用D-Hank's液洗涤3次去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光扫描共聚焦显微镜检测。结果：空白对照组中细胞内未见荧光，说明此时胞内无钙离子，但从1 min开始在细胞中发现荧光，而且发现随着照射时间的加长，其荧光强度越来越强，这可能与微激光照射时间越长从而刺激胞内出现更多的钙离子有关。从上面的实验说明850 nm微激光能作为仿灸仪器的光源。

生物光学；细胞内钙离子浓度；微激光；肥大细胞；激光扫描共聚焦显微镜

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.004

0　引言

激光针灸是一种新的针灸疗法，它通过采用激光照射人体穴位替代传统毫针刺激穴位实现针灸治疗的目的［1-3］。和传统的毫针针灸相比，激光针灸具有非侵入性的特点，能降低因重复使用针具而发生交叉感染的风险。而且，激光针灸能缓解部分晕针患者（特别是儿童患者）对针具的恐惧心理。有研究表明激光针灸镇痛具有良好的疗效。Sven Gottschling等人采用830 nm激光器治疗患有头痛的儿童患者，激光辐照的穴位点选择“合谷”、“足三里”、“三阴交”等。统计结果显示激光针灸组的治疗相对于对照组具有显著效果［4］。但是由于激光器的成本过高及操作复杂阻碍了它的应用进一步推广［5］。随着现代科技的发展，新型的LED将以其在光强、波长、价格、寿命、外型尺寸等方面的优势和与激光光源治疗具有相似的疗效成为医疗的新能源。例如前期王波等人已研究采用635 nm LED穴位照射对肾阳虚模型的影响，结果发现635 nm LED照射与艾灸疗法对肾阳虚模型动物的治疗具有相似的疗效，说明635 nm LED可做为仿灸仪器［6，7］。

虽然针灸镇痛效应及其作用机制已得到广泛研究并取得了一定的进展，但是有关激光针灸镇痛作用机制的研究相对较小，而且人们对其作用机制知之甚少。大量中医研究表明机体穴位区肥大细胞参与镇痛效应，而肥大细胞的脱颗粒线显示产生此效应的一个重要环节。本实验的目的主要研究850 nm微激光对肥大细胞内钙离子的影响。

1　材料与方法

1.1激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscopy，LSCM）是采用激光作为激发光源，激光束经显微镜光学部件后照射荧光标记的样本上，激发出的荧光信号被光检测器接收。该技术是在荧光显微分析技术的基础上发展起来的，利用荧光显微镜可以对生物样品发出的荧光进行观察和分析。采用通过针孔，挡住非焦平面的散射光，以减少焦平面上非测量点光信号干扰，通过扫描技术，可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息，成像清晰程度得到大大提高。同时，通过显微镜自带的部件和软件，可以实现样品的Z轴扫描和三维重构。当物镜折射率一致时，采用激光扫描共聚焦显微镜可以使分辨率提高1.4倍，能够在亚细胞水平上观察诸如钙离子、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。激光扫描共聚焦显微镜广泛应用于生物医学的基础研究中，其中最常见的应用是荧光定性和定量检测［8，9］。例如，李瑞午等提出利用激光扫描共聚焦显微镜技术研究针灸经络的思想，并观察电针血清与正常血清对体外培养的大脑皮层细胞钙离子的影响［10，11］。

1.2细胞质内的钙离子

钙信号在细胞的信号传导和执行功能等各个方面都发挥着重要的作用，影响着从卵子受精到细胞调亡的整个生命过程。Ca2+既能充当第一信使启动信号传递过程，也能充当第二信使，同时还调控细胞的生命过程，如递质释放、腺体分泌，肌肉收缩到细胞受精、发育、分化、凋亡等，都和钙离子有关。静息情况下，细胞外Ca2+浓度在mmol/L量级，而胞内Ca2+浓度（［Ca2+］）则为μmol/L水平，两者相差1 000i～10 000倍［12，13］。

1.3胞内钙离子的荧光测定法

Fluo-3是一种长波钙荧光探针。因为激光扫描共聚焦显微镜具有氩激光器，所以Fluo-3被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也有利于减小对样品细胞的光损伤。Fluo-3/AM是Fluo-3的一种乙酰甲酯（Acetoxymethyl ester，AM）衍生物，脂溶性，很容易透过胞膜进入细胞，但不和钙离子结合，没有荧光，该探针是应用最广泛的几种检测钙离子浓度的探针之一。当FLuo-3/AM被细胞内的酯酶催化失去AM后，产生的Fluo-3变成水溶性而不能透过胞膜流出细胞外。Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子结合后荧光会增加60～80倍。

1.4主要试剂与仪器参数

细胞培养板、培养瓶、共聚焦培养皿（Cornning公司）。Fluo-3/AM（钙离子荧光探针，Biotium）；DHank's液:自行配置；胎牛血清（FBS，Gibco公司）。

激光扫描共聚焦显微镜LSM710（广东省农业科学院农业生物基因研究中心，如图1）:德国ZEISS公司，参数设置如下:60倍油镜，激发光波长为488 nm，探测器波长范围为490 nm～600 nm。

1.5微激光处理

采用中心波长在850 nm的近红外LED（FWHM =30 nm）（图2），24个LED灯珠以6×4排列方式组合成一个LED阵列，其大小主要根据96孔板的大小来定。

图1　激光扫描共聚焦显微镜（LSM710）Fig.1　Laser scanning confocalmicroscopy（LSM710）

图2　850 nm LED的光谱Fig.2　The spectrum of LED with a central wavelength of 850 nm

1.6实验方法

选用RBL-2H3细胞为细胞模型。实验前12 h，将RBL-2H3细胞接种于激光共聚焦专用培养皿中；开始实验前，配置好10 μmol/L的Fluo-3/AM溶液（50 μg溶于22 μL DMSO，再用D-Hank's液稀释到4.4 mL），然后放入在37℃培养箱中孵育30 min备用；将已接种于激光共聚焦专用培养皿中的细胞用D-Hank's液洗涤3次，加入2 mL D-Hank's液，分六组，每组按照表1的处理方法进行照射，其中，空白对照组不进行微激光照射处理；微激光照射后，弃去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培养箱（37℃，5%CO2）中孵育30 min后，弃去含Fluo-3/AM的D-Hank's液，用D-Hank's液洗涤3次以去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光扫描共聚焦显微镜检测。

2　结果和分析讨论

表1　850 nm的微激光照射肥大细胞时所对应的功率密度和能量密度Tab.1　The power density and energy density of 850 nm micro-laser irradiated mast cells

图3　肥大细胞经中心波长为850 nm微激光分别照射0 min和1 min后钙离子显微成像（左边图为白光图，中间图为纯荧光图，右边图为白光图和荧光图合并图）Fig.3　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 0 min and 1 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

图4　肥大细胞经中心波长为850 nm微激光分别照射2 min和2.5 min后钙离子显微成像（左边为白光图，中间为纯荧光图，右边为白光图和荧光图合并图）Fig.4　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 2 min and 2.5 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

图5 肥大细胞经中心波长为850 nm微激光分别照射3 min和4 min后钙离子显微成像（左边为白光图，中间为纯荧光图，右边为白光图和荧光图合并图）Fig.5　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 3 min and 4 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

图3为肥大细胞经中心波长850 nm微激光照射0 min和1 min后的荧光图，从图上发现在微激光照射0 min（空白对照组，即微激光光源处于关闭状态）未见荧光，但是相同参数下测得经850 nm微激光的光照射肥大细胞1 min荧光图片上可见微弱的荧光，说明肥大细胞经中心波长850 nm微激光刺激1 min能使其钙离子浓度升高。

图4和图5分别是在相同激光扫描共聚焦显微成像的参数下测得经850 nm微激光的光照射肥大细胞2 min、2.5 min、3 min、4 min。从图上可见随着照射时间的加长，胞内钙离子的荧光强度也随着增加，这可能是因为光灸效应作用分子能够引起活细胞的细胞质中的钙离子增加。前期黄义梅等人研究得出光灸效应作用分子引起钙离子浓度升高的途径可能为两种:第一种是细胞外钙离子内流，另一种是细胞内钙库释放钙离子到细胞质中。细胞内钙库释放钙离子可能是光灸效应作用分子引起细胞质中钙离子升高的主要原因［14，15］，本实验结果与黄义梅研究结果一致。另外还发现在照射后2 min、2.5 min和3 min细胞形态较完整。但是经850 nm微激光照射肥大细胞4 min后，有小部分肥大细胞破碎丧失细胞完整性，说明该剂量的微激光辐射对细胞会造成损伤。

本实验中，使用微激光850 nm波长的光照射肥大细胞的结果表明，850 nm的光能够有效刺激肥大细胞胞内钙库释放钙离子至细胞质中以引发进一步细胞反应，例如肥大细胞脱颗粒释放组胺。同时因为大量中医研究表明机体穴位区肥大细胞参与镇痛效应，而肥大细胞的脱颗粒线显示产生此效应的一个重要环节。肥大细胞脱颗粒产生组胺、P物质可通过以下两种方式共同作用到靶器官:①通过组织液定向流动传递到沿经脉线上的其他肥大细胞处诱使其进一步脱颗粒；②活性物质刺激神经末梢引起轴索反射，再次释放P物质，诱发肥大细胞脱颗粒，颗粒物质进一步刺激相邻神经末梢，如此往复，光灸神经兴奋信号在不同阶段被整合和修饰后产生镇痛和其他靶器官调整效应。

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The Effect of Micro-laser on Intracellular Free Calcium Concentration of Mast Cell

ZHONG Huiqing1，YANG Hui2，ZHOU Yan2，GUO Zhouyi1*，HUANG hanchuan1，YE Bingang1，NI Yirong1，XIONG Honglian1，JIN Mei1，WU Xiuli1，SU Chengkang1，LONG Jia2，LIN Jin2
（1.SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China；2.Infinitus（China）Company Ltd，Guangzhou 510623，Guangdong，China）

Objective:To investigate the effects of micro-laser irradiation on intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）of mast cell.Methods:12 hours before the experiment，The mast cells were seeded into paltes，which wereused on the laser scanning confocal microscopy（LSCM）.Then the cells were washed three times with D-hank's solution，and added 2 mL D-hank's solution to each group.There were six groups，which were irradiated at different times（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min）by micro-laser 850 nm.The control group was irradiated 0 min.After micro-laser irradiation，the cells were removed the D-hank's solution，and loaded with 1 mL Fluo-3/AM at 37°C for 30 min.The cells were washed again for another three times with D-hank's solution to remove the unloaded Fluo-3/AM in the medium，and then added 2 mL D-hank's solution with 10%FBS.The images of Ca2+concentration in each group cells were monitored by LCSM.Result:The results have shown that there were no fluorescence in the control group.It clearly indicated that there were no Ca2+in the control group cells.But in the irradiated 1 min group，there was significant fluorescence.Following the time of irradiation increasing，the fluorescence intensity were enhanced.The intracellular calcium concentration become higher，which may be related to the micro-laser irradiation time increase.It has shown that the 850 nm micro-laser could be the optical source of moxibustion instrument.

biological optics；intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）；micro-laser；mast cell；laser scanning confocal microscopy（LSCM）

Q682

A

1007-7146（2015）04-0326-05

2015-05-24；

2015-06-02

无限极（中国）有限公司委托重大技术开发项目（HPG/2013/11/1598）；国家自然科学基金项目（No. 61335011，No61275187；No.31300691&No.11404116）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（No.20114407110001&No.20134407120003）；广东省自然科学基金重点项目（No.2014A030311024）；广东省重大科技专项项目（No.2012A080203008）；广东省教育厅科技创新项目（No.2013KJCX0052）

钟会清（1979-），女，湖南衡阳，讲师。研究方向:生物医学光子学、光谱检测与成像、光学诊断。（电子邮箱）zhonghq@scnu.edu.cn

郭周义（1965-），男，浙江诸暨人，教授，博士生导师。（电子邮箱）ann@scnu.edu.cn