光动力学结合声动力学治疗对小鼠鳞癌细胞超微结构的影响*

堵建岗，劳力民

（1.浙江大学医学院附属二院皮肤科，浙江杭州310009；2.绍兴市中心医院皮肤科，浙江绍兴312030）

光动力学结合声动力学治疗对小鼠鳞癌细胞超微结构的影响*

堵建岗1，2，劳力民1

（1.浙江大学医学院附属二院皮肤科，浙江杭州310009；2.绍兴市中心医院皮肤科，浙江绍兴312030）

目的：评价光动力疗法（PDT）联合声动力学疗法（SDT）对小鼠鳞癌超微结构的影响。方法：以镓卟呤衍生物ATX-70作为光敏剂和声敏剂，分别用光动力疗法、声动力疗法以及两者联合应用处理小鼠鳞癌，利用透射电镜观察不同时间段取材的细胞超微结构的变化。结果：激光或超声激活ATX-70对鳞癌细胞超微结构的破坏程度随取材时间的延长而加剧，联合应用对肿瘤细胞破坏程度更明显。损伤位点主要集中在胞膜、线粒体、内质网及细胞核上，同时还观察到一些肿瘤细胞表现出明显的凋亡特征。结论：光动力学结合声动力学疗法比单用肿瘤细胞破坏程度更明显，主要通过破坏细胞超微结构杀伤肿瘤细胞，部分通过诱导凋亡杀伤。

光动力学治疗；声动力学治疗；鳞癌；超微结构

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.005

光动力学治疗（Photodynamic therapy，PDT）是一种新颖的治癌手段，其利用被肿瘤吸收储留的光敏剂在特定波长激光照射下的光化学反应来选择杀伤癌细胞，近几年该方法在国内外得到广泛应用。由于PDT治疗深度约0.5 mm-2.0 mm，仅限于浅表皮肤肿瘤。为了克服PDT的局限性，目前人们致力于研究PDT与化疗、热疗、微波疗法等联合应用［1］。利用超声波激活血卟啉产生抗肿瘤效应的声动力学疗法（Sonodynamic therapy，SDT）已成为近几年国内外研究者关注的热点之一［2］，然而对于PDT和SDT联合应用的研究尚少，特别是形态学证据报道更缺乏。我们以C3H/HeN鼠的移植性鳞癌模型为研究对象，进行PDT和STD联合应用的研究，用透射电镜观察治疗后瘤细胞以及微血管内皮细胞早期变化，为探讨增强PDT对肿瘤治疗作用的新途径提供形态学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1肿瘤模型 肿瘤来自C3Hf/HeN3小鼠自发产生的鳞癌，传代维持于C3H/HeN小鼠皮下组织内。取健康C3H/HeN鼠30只，鼠龄3-8周，雄雌各半，体重20±2 g，在室温（18-20℃）条件下养育1周后，无菌条件下将3 mm×3 mm×3 mm肿瘤组织接种于C3H/HeN小鼠背部近左腋窝处，用游标卡尺测量种植的肿瘤，当肿瘤直径7 mm-10 mm时进行实验。

1.1.2试剂 光敏剂PH-1126和声敏剂镓卟呤衍生物--ATX-70（Toyo Hakka Kogyo Ltd，日本），均用生理盐水溶解，终浓度1 μg/mL，过滤、灭菌、分装、避光贮存于-4℃。

1.1.3激光系统 氪离子激光（LKI-2503型，东芝，日本），波长575 nm，光纤输出垂直照射，光斑直径2 cm。

1.1.4超声激发系统 MG442A型超声发生仪（Anritsu Electric，日本），超声频率1.099 MHz，声强0.5±0.01 W/cm2，44±1 V，探头直径12 mm。

2　实验方法

将符合上述条件的荷瘤小鼠随机分为四组，每组5只。对照组:不作任何处理；PDT组:小鼠于照光前24 h尾静脉注射PH-1126，使用浓度为5 μg/kg，避光。照射部位局部脱毛，小鼠固定后，用650 nm激光光导纤维头端对准肿瘤中心照射30 min，功率密度为75 mW/cm2，总能量44 J/cm2；SDT组:小鼠于治疗前36 h尾静脉注射ATX-70，使用浓度为2.5 μg/kg，避光。1.0 MHz超声探头紧贴肿瘤基底，中间敷以超声导电凝胶，声照处理10 min，强度0.51 W/cm2。为保持声照过程中肿瘤组织温度＜42℃，超声发送器附有循环水冷却系统；PDT+SDT组，小鼠肿瘤部位先进行PDT治疗，治疗条件同PDT组。激光照射后立即予以超声波处理，治疗条件同SDT组。于治疗后即刻、1 h、3 h时分批处死小鼠，瘤组织取材作透射电镜检查。所获肿瘤组织迅速细切成1.0 mm3的小块，用0.01 mol/L PBS液清洗后，以2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，逐级酒精脱水，Epon-812包埋，超薄切片，进行醋酸铀-枸橼酸铅染色，日立H-300型透射电镜下观察肿瘤细胞和血管内皮细胞超微形态变化。

3　结果

3.1肿瘤细胞超微结构变化

3.1.1空白对照组 肿瘤细胞大小不一（图1），细胞核大，核膜清晰，有核切迹，染色质着色均匀，核仁数多为1-2个，细胞质中可见发达的内质网、游离的核糖体，卵圆形的线粒体数量较多，嵴清晰完整。微血管内皮细胞结构完整。

图1　正常对照组：肿瘤细胞异形性明显。×2 000Fig.1　Normal control，apparente heteromorphism in Tumor cells.×2 000

3.1.2 PDT组 治疗后即刻，数处可见肿胀的肿瘤细胞，大小不一，微绒毛缩短，核内染色质边集，线粒体肿胀，嵴模糊，但可见有活性肿瘤细胞。微血管内皮细胞粗面内质网可见扩张。治疗后1 h时（图2a），肿瘤细胞膜受损，微绒毛减少或消失，明显的线粒体肿胀、线粒体嵴断裂。内皮细胞病变较前加重，较小空泡形成。治疗后3 h时，瘤细胞膜界限不清，细胞内线粒体瘠模糊或大多消失，空泡形成，数量较多，胞质丢失，出现空区，并可见核物质凝集、细胞核固缩等细胞凋亡形态学特征（图2b）。内皮细胞明显退变，部分坏死。

3.1.3SDT组 治疗后即刻肿瘤细胞内线粒体轻度肿胀变形，部分细胞核物质聚缩深染；1 h时肿瘤细胞有形变（图3a），微绒毛减少，瘤细胞内线粒体轻度肿胀，数量减少，部分形成空泡化结构，血管内皮细胞内可见部分线粒体肿胀。治疗后3 h时，肿瘤细胞膜破损，线粒体结构模糊，可见少量凋亡小体（图3b）。

3.1.4PDT+SDT组 PDT+SDT组与PDT组比较，可见更加严重的损伤，两者之间超微结构无特殊改变，仅为程度上的差异，如治疗后即刻的变化（图4a），接近于PDT组治疗后3h时的改变，肿瘤细胞内有较多巨大空泡，染色质溶解、消失，细胞器严重变性等为突出表现。血管内皮细胞内空泡更为明显（图4b）。

图3　a.SDT组：肿瘤细胞轻度水肿，其内也可见小空泡；b.SDT组：凋亡肿瘤细胞较少。×2000Fig.3　a.SDT group，low-grade edema and little cavities in tumor cells；b.SDT group，fewer apoptotic cells×2 000

图4　a.PDT+SDT组：肿瘤细胞水肿更明显空泡更多、更大；b.肿瘤巢旁毛细血管内皮细胞内空泡明显。×2 000Fig.4　a.PDT+SDT group，all the more apparente edema and bigger cavities in tumor cells；b.PDT+ SDT group，apparente cavities in capillary endothelial cells by the side of neoplasms.×2 000

4　讨论

以血卟啉类光敏剂为核心的PDT成为继手术、放疗和化疗之外的第四种成熟的肿瘤治疗方法，SDT是在PDT的基础上建立和发展起来的。1990年Yumita等利用超声波结合血卟啉对S100小鼠移植瘤进行了抗肿瘤效应观察［3］，发现单独使用血卟啉或超声波仅有微弱抗肿瘤作用，二者结合对肿瘤细胞有抑制作用。与激光不同，超声波是机械波，可靶向聚焦，具有良好的组织穿透能力。在声动力学介导下，声敏剂能够特异性地杀伤肿瘤细胞，对正常组织无明显损伤作用。

Miyoshi等相继发现声敏剂镓卟呤衍生物ATX-70在超声激发下产生的声敏化作用能杀伤恶性肿瘤细胞［4］。Jin等应用小鼠的鳞癌模型进行PDT和SDT联合应用的研究［5］，结果证明联合治疗导致的组织坏死的深度是单用一种疗法的2-3倍，联合作用可使PDT作用下不能杀伤的深部肿瘤细胞，在SDT作用下变性坏死。我们在Jin等实验基础上观察了PDT和SDT治疗前后鳞癌细胞和肿瘤间质内毛细血管内皮细胞超微形态变化，发现单纯PDT或SDT都对鳞癌细胞有杀伤作用，但PDT之后进行SDT对细胞的杀伤作用明显增强，并且发现损伤随时间推移而加剧。这些结果提供了PDT与SDT联合应用具有协同效应的超微形态学证据，为扩大PDT在肿瘤治疗中的应用提供了新的实验基础。

PDT的生物机制是以化学反应为基础，主要体现在两个方面:①对肿瘤细胞的直接杀伤作用；②通过作用于肿瘤组织的微血管造成血管的完全封闭，使肿瘤组织缺氧和营养枯竭。两种机制以何种为主依不同的光敏剂而异。本文实验发现，无论PDT或SDT治疗后鳞癌细胞超微结构都显示质膜、线粒体损伤，并且发现损伤随时间推移而加剧；同时也观察到了肿瘤间质内毛细血管内皮细胞内线粒体肿胀，部分内皮细胞坏死现象。这从形态学上证实了PDT和SDT作用的靶位均是细胞膜和线粒体等膜性细胞器，对肿瘤细胞和肿瘤组织的微血管均有杀伤作用。

目前，PDT的作用机理已得到了普遍认可，应用比较广泛。尽管SDT在肿瘤治疗领域表现出良好的应用前景，由于体内作用机制复杂［6，7］，对其基础方面的研究如超声激活声敏剂以及破坏肿瘤细胞的机理尚不清楚。已有许多实验证实PDT具有诱导细胞凋亡的作用［8］，本文在SDT组也观察到了鳞癌细胞有核物质凝集、趋胞膜边缘排列以及凋亡小体形成等细胞凋亡特征，提示超声激活ATX-70杀伤鳞癌细胞的过程中也可能存在着细胞凋亡的模式，这一结果与使用血卟啉的PDT结果相似。在形态学研究的基础上，今后如能进一步了解作用的分子机制可能涉及到膜受体介导的凋亡信号调节通路［9］，必将会极大地推动PDT和SDT的改进和提高，使其更好地造福人类。

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Effect of Sono-photodynamic Combination Therapy on the Ultrastructure of Squamous Cell Carcinoma in Mice

DU Jiangang，LAO Limin
（1.Department of Dermatoloty，the Second Affiliated of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310009，Zhejiang，China；2.Department of Dermatoloty，Shaoxing Central Hospital，Shaoxing 312000，Zhejiang，China）

Objective:To observe the ultrastucture of experimental squamous cell carcinoma in mice after sono-photodynamic combination therapy.Methods:Analogues of a gallium-porphyrin derivative（ATX-70）was used as photosensitizer and sonosensitizer in this study.The squamous cell carcinoma in mice was treated by photodynamic therapy，sonodynamic therapy and sono-photodynamic combination therapy respectively.The changes of ultrastructure of sample preparation for different time were observed by transmission electron microscope.Results:The degree of destruction of treated squamous cell carcinoma cells was enhanced with the increasing of time，which was induced by photo-activated or ultrasound-activated ATX-70.However，the sono-photodynamic combination therapy was more effective.The sites destroyed mainly involved cell membrane，mitochondrion，endoplasmic reticulum and cell nuclei.Furthermore，morphoiogical characters of apoptosis were observed on cancer cells.Conclusion:This study suggested that the sono-photodynamic combination therapy is more effective in terms of its antitumor effect when compared with photodynamic therapy or sonodynamic therapy alone.The killing of tumor cells was ascribed mainly to the damage of ultrastructure，apoptosis wasalso induced during the killing process.

photodynamic therapy；sonodynamic therapy；squamous cell carcinoma/ultrastructure

R454

A

1007-7146（2015）04-0331-04

2014-12-02；

2015-06-12

堵建岗（1973-），男，副主任医师，在职研究生，主要从事皮肤肿瘤的诊治研究。（电话）13588585466；（电子信箱）djgdd1973@163.com

劳力民，男，教授，硕导，主要从事皮肤肿瘤超微形态学研究。（电话）13757128332；（电子信箱）laolimin163@163.com