结直肠癌早期诊断的研究进展＊

刘嫩容，汪 跃，廖发电，黄少华，陈 荣

(医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建师范大学，福建 福州 350007)

0 引言

癌症仍是当今世界人类健康面临的最大挑战，我国近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势。全国肿瘤登记中心发布《2012中国肿瘤登记年报》显示:我国每分钟就有6人确诊为癌症，其中结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)发病率居第3位，占癌症死因第4位。结直肠癌是一种可以预防、早诊早治的恶性肿瘤，“三早”(早期发现，早期诊断，早期治疗)是提高结直肠癌治疗效果的最有效方法。临床资料显示:早期癌症病人术后5年存活率高达90%以上［1］。然而，由于结直肠癌早期无明显症状且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术，大部分患者确诊时已是癌症晚期，失去了最佳治疗时机，导致术后5年存活率很低(低于20%)。再者，由于缺乏对结直肠癌变产生发展机制及治疗预后响应机制的准确认识，目前结直肠癌的病因尚不明确。流行病学调查结果显示结直肠癌的发生可能与遗传因素、饮食因素、慢性炎症、病毒感染、环境以及免疫功能失常等因素密切有关。因此，探索结直肠癌的产生发展机制以及建立早期结直肠癌无损快速诊断及治疗评估方法已经成为当前医学界重点攻关难题。

本文首先简要介绍了结直肠组织微结构和癌变进程，总结了现有临床诊断方法及其不足，着重探讨了非线性光谱技术在结直肠癌早期诊断中的最新进展。

1 结直肠组织微结构

正常结直肠组织是层状上皮结构，主要分为四层:粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜，粘膜层又分为:1)上皮 (epithelium):单层柱状上皮，有柱状细胞和杯状细胞。直肠齿状线以上与结肠相似，为单层柱状上皮，齿状线与痔环之间为未角化的复层扁平上皮，痔环以下为角化的复层扁平上皮。2)固有层(lamina propria):为疏松结缔组织，细胞成分较多，纤维较细密，有丰富的毛细血管和毛细淋巴管，有长单管状的大肠腺，无潘氏细胞，有孤立淋巴小结。3)粘膜肌层 (muscularis mucosa):为薄层平滑肌，其收缩可促进固有层内的腺体分泌物排出和血液运行，利于物质吸收和转运。粘膜下层主要富含疏松结缔组织，有成群脂肪细胞。肌层结构特征为内环外纵，外纵行肌局部增厚形成三条结肠带。结肠外膜除升、降结肠后壁为纤维膜，其余均为浆膜。直肠外膜上1/3段和中1/3段的前壁为浆膜，其余为纤维膜［2］。结直肠组织层状结构如图1所示［3］。

图1 正常结直肠组织层状结构示意图［3］Fig.1 Layered microstructure schematic diagram of normal colorectal tissue

2 结直肠组织癌变进程

任何癌的产生都会出现细胞或组织的异型性，病理学上用“异型增生”表述肿瘤细胞或组织形态变化，将出现异型增生而未出现侵袭行为的统称为癌前病变。肿瘤细胞侵袭行为是判断癌前病变和癌变的关键，因此正确判断异型细胞是否发生浸润在病理诊断上非常重要。由于各种器官组织的特性不同，肿瘤细胞出现侵袭行为判断为癌的标准也不同。结直肠癌细胞侵袭的标志主要是观察基底膜和粘膜肌层的突破。粘膜内腺体完整性破坏则提示基底膜突破，瘤细胞侵袭局限在基底膜在粘膜内浸润称为粘膜内癌，瘤细胞浸润到粘膜下层则提示粘膜肌层突破，称为粘膜下层癌。习惯上，将粘膜内癌和粘膜下层癌统称为早期癌。瘤细胞若突破粘膜下层则为进展型癌，特别指出，结直肠癌变中95% 以上是腺癌［4-5］。图2 所示为腺瘤癌变途径示意图［6］。

3 结直肠癌临床诊断方法

近20年，结直肠癌在诊断方面取得了很大进展，各种诊断方法不断改进，新诊断方法和技术不断涌现，对结直肠癌的早期诊断、定位和分期提高到了一个新的认知水平。

图2 结直肠组织腺瘤癌变途径示意图［6］Fig.2 Canceration process schematic diagram of colorectal adenoma

3.1 肠道排泄物诊断法

大便隐血试验(fcecal occult blood testing，FOBT)［7-8］是CRC常用的初筛方法，以肿瘤的伴随症状--出血为检测对象，具有操作简便、无创等优点，但FOBT诊断的灵敏度和特异性差异较大，影响因素复杂。脱落癌细胞检测方法通过检测粪便内CRC脱落细胞的微量DNA，具有有较高的灵敏度和特异度，为结直肠癌的早期诊断开辟了新的途径。但该方法分离过程繁琐，易受细菌、食物及肠道黏液等干扰。粪便基因检测(stool DNA testing，sDNA)［9-11］较 FOBT具有更高的灵敏度和特异性，人群依从性较好，但由于检测位点多，成本高，限制了临床应用。由于CRC发病的复杂性，目前尚未找到理想的诊断标志物。

3.2 结肠镜诊断法

结肠镜检查是目前CRC最基本的诊断手段。通过放大结肠镜能够在活体情况下看到亚细胞结构，结合三维重建技术，可以判定病变的性质，其与活检病理诊断的符合率高达95%［12］。联合窄带成像技术，无需染色即可获得与内镜下染色相同的视觉效果，可实现对早期CRC作出实时、准确的诊断［13］。CT虚拟结肠镜利用计算机断层扫描技术和三维图像重构，可获得与结肠镜相似的进展期CRC检出率，尽管其对早期结CRC和结直肠息肉的诊断不如结肠镜检查，而且影响因素众多，对设备和技术的要求也很高，误诊率较高，但具有结肠镜或钡灌肠等无法比拟的优点，如检查时间短、无创、无痛苦等。

3.3 影像学诊断法

影像学诊断在明确CRC的诊断、确定系统治疗方案、选择外科手术术式及监测预后等方面中，都发挥了重要的作用，受到越来越多临床医生的重视［14-16］。CRC的影像学诊断方法，包括:钡剂灌肠(barium enemas，BE)、腔内超声 (endoscopic ultrasound，EUS)、计算机体层摄影 (computed tomography，C T)、磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)和正电子发射体层摄影(positron emission tomography，PET)等。上述影像学方法各有优点和劣势，目前医生通过上述的一些技术手段很容易对中晚期癌症做出临床诊断。但是，鉴于上述方法受空间分辨率的限制(毫米量级)，无法获得结直肠组织早期病变的微结构信息，尚无法实现早期CRC诊断。

4 激光共焦显微成像技术

1990年激光共聚焦扫描技术的出现，共焦显微镜成为生物组织非侵入式显微成像的有力工具，被广泛用于皮肤、胃肠、角膜等组织微结构形态病理分析［17，18］，尤其是其与内窥镜技术相结合，可实现活体组织实时高分辨显微成像，引起人们广泛关注［19-22］。共聚焦激光显微内窥镜系统能直接进入人体或动物模型的内部器官，无需取样和组织病理学检查即可实现高分辨率的实时组织学诊断和一定深度的断层扫描成像。通过使用荧光对比剂，特异性强，操作简单，避免了重复内镜检查和多次取样，成为无创性诊断早期肿瘤及其癌前病变的重要方法。文献［19］获取了42例大肠病变患者的共聚焦显微图像，并据此做出判定，病理核实准确率达99.2%，诊断灵敏度和特异性分别为97.4%和99.4%。可以说激光共焦扫描内窥镜为内部器官肿瘤的早期诊断产生了划时代的意义，是当前CRC早期诊断的研究热点之一。但是，激光共焦显微镜存在一个致命弱点，即穿透深度浅，成像深度仅局限于粘膜层，并且对生物组织具有光毒性和光漂泊作用。为了增加成像对比度往往使用荧光增强标记，增加了病人风险。因此，亟需开发一种能够对结直肠癌组织微观形态学和内在分子组分光谱学进行客观无损地诊断和监测的高分辨率、高灵敏度的深度分辨光谱成像技术。

5 TPEF和SHG的非线性光谱成像技术

以飞秒激光与生物组织相互作用产生的双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence，TPEF)和二次谐波(second harmonic generation，SHG)等非线性光学效应作为信号源的多光子显微成像技术(multipnoton microscopy，MPM)可以同时获得组织内在成分的高灵敏度和高空间分辨率微结构成像和光谱特性，并具有“光切”功能、低杀伤性且成像深度深等特点，已被广泛用于子宫、胃肠、食道、皮肤等生物医学的各个领域，成为国际生物医学光子学研究领域最前沿的课题［23-26］。胃肠等生物组织的许多内在成分无须外加标记即能产生较强的自体荧光和二次谐波信号，比如弹性蛋白、色氨酸、黄素蛋白 FAD、还原性辅酶 NADH、血管、卟啉及其衍生物能产生双光子激发荧光;具有非中心对称结构的胶原蛋白、肌肉、肌浆球蛋白等能产生二次谐波信号。因此，多光子显微光谱成像技术能够广泛用于无损检测细胞、组织乃至器官的生物分子组织形态学，被认为是可能实现临床医学无损层析成像最有前途的光学手段之一。另一方面，在结直肠癌变进程中，组织体的微观形态以及相关生化成分会发生改变并导致发射光谱发生相应变化，这种变化往往携带组织体病变信息，因此有可能作为结直肠癌早期诊断和治疗评估的参数指标。

国内外许多研究组对多光子显微成像技术开展了研究［23-31］，初步揭示了正常、癌前、癌变层状上皮组织的内源性荧光差异［23］;证实了多光子显微成像技术无需标记便可获得细胞微结构详细信息［24］;提出了一些用于表征和判定组织细胞生理和病理特性的指标参量:如细胞形态及其 NADH和FAD的双光子激发荧光比值已被用作研究细胞能量代谢的一种重要指标［25，26］;胶原纤维以及弹性纤维含量、形态和方向及其SHG/TPEF强度比等参数被认为可用作表征癌变信息的评估指标［27-31］，等等。特别值得关注是，作者所在研究组首次提出采用多通道探测成像技术和光谱分辨成像技术相结合的多模式方法，对正常和异常人体皮肤、食道组织、口腔粘膜等上皮组织进行了高对比度和高分辨率的微结构光谱成像，初步提取了一些可用于表征组织病变信息的特征参量［32-36］。文献［35］首次报道了结肠正常肌层内斜中横外纵的肌纤维微结构特征以及癌细胞侵入肌层后微结构的变化，如图3所示(红伪彩色显示是双光子激发荧光信号(TPEF)，绿伪彩色显示的是二次谐波信号(SHG)，图3中白色环形曲线显示腺癌占据了肌层空间，肌纤维严重缺失特别是产生SHG信号的网状肌纤维。

图3 左边:正常结肠肌层内斜中横外纵(imp-mmp-omp)的肌纤维微结构特征;右边:中间肌层癌细胞侵入前后的微结构对比图［35］Fig.3 left:inner oblique，middle transverse and outer longitudinal muscle fiber microstructure feature of normal colonic muscularis propia(imp-mmp-omp);right:the middle muscle fiber microstructure of normal and cancer cell invading into muscularis propia

尽管已有研究成果预示着多光子显微成像技术在结直肠癌早期诊断和治疗评估表现出诱人的前景和巨大潜力，但是，多光子显微成像技术真正走向临床应用还存在许多基本问题亟待解决。首先，结直肠癌变进程中，其内在组分如细胞、胶原纤维、弹力纤维等的形态、分布等结构特征存在差异，当飞秒激光与之相互作用时，这种差异性表现为吸收系数、散射系数以及衰减系数的差异，并最终影响成像的质量和深度。如何针对这种差异性选择合适的激发波长和激发功率等激光辐照参数，以期获得高分辨率、高对比度深度成像和光谱特性就显的尤为重要。其次，不仅正常以及癌变不同病程结直肠组织的微观形态存在差异，同一类型结直肠癌组织，其粘膜层上皮、固有肠腺以及粘膜下层胶原蛋白和弹力纤维等存在较大的个体差异。其微观形态通常还随病人的年龄、性别、癌变时间、病灶部位等存在差别，即使在同一样品中，粘膜下层不同位置的胶原蛋白和弹力纤维形态也存在一定差异。如何从众多差异中，提取能定量表征不同病程结直肠癌变信息的特征参量是实现结直肠癌早期诊断和治疗评估的关键。此外，目前针对结直肠癌非线性光谱成像研究还主要局限于组织形态学层面，对癌症的发生、发展和转移，特别是术后的高复发还缺乏足够的认识。因此，有必要研究结直肠癌细胞的生物学特性，建立能定量表征不同病程结直肠癌的细胞特征参数，监测癌变进程细胞代谢等功能特征，探索外界因素对细胞生长代谢等功能的影响。

6 拉曼光谱技术

蛋白质、脂类、碳水化合物和核酸四大类物质是构成正常细胞和组织的主要物质。细胞和组织的病变总是从构成他们的分子开始的，在细胞和组织早期病变过程中，这些化学物质、构象和数量都会发生明显变化，这些早期的变化并不引起临床症状和组织内在成分的微结构变化，以双光子激发荧光(TPEF)和二次谐波(SHG)为信号源的非线性光谱成像技术显然无法检测这种变化，而拉曼光谱却能反映这些变化。拉曼光谱技术能够从物质的分子振动光谱来识别和区分不同的物质分子结构，从分子水平研究和判定生物组织内在成分的详细信息，克服了荧光光谱技术区分病变组织的缺陷，即由于生物大分子荧光带较宽，易重叠，影响诊断的准确性。因此，拉曼光谱有望成为癌症早期诊断以及癌变机制研究的重要手段［37-41］。

早期，人们主要利用组织切片的拉曼光谱来分析癌症肿瘤的类型，寻求不同类型癌症诊断标志物。文献［37］获得了乳腺癌的拉曼光谱，结合数值拟合，得到了各种不同类型乳腺癌的基本特征物质的含量，该方法在从正常和良性组织中区分癌变组织的灵敏度和特异性分别达到了94%和96%;文献［38］通过对比胃癌和正常胃黏膜的拉曼光谱，确定了胃癌的特征峰，证实拉曼光谱可用于来诊断胃癌。近年来，利用血清的拉曼光谱进行CRC的诊断引起人们的极大兴趣。血清是人体血液中的重要组成部分，血清白蛋白富含多种蛋白质，可以全面表征个体信息，血清中的抗体(免疫球蛋白)是体内最主要的抗体，对各种细菌、病毒都有很强的抵抗力。分析血清的拉曼光谱可以深入了解血清中所包含各种物质的性质，它对临床的研究有着极其重要的意义。特别是近年来表面增强拉曼散射(SERS)技术的发展，克服了常规拉曼的固有缺陷，能够在几秒时间内很容易探测到物质内部微观世界的信息，同时又能够对荧光产生很好的抑制、猝灭作用［39-42］。课题组前期工作已经利用SERS技术对鼻咽癌、胃癌和结直肠癌进行基础研究，证实癌变组织与血液样品生化成分、含量以及生物分子结构上与正常健康人样品存在很大的差异［43-45］。文献［45］对正常血清与结直肠癌血清的SERS平均光谱进行了对比分析，并且利用主成份统计分析方法对SERS光谱的主成份PC1，PC2，PC3进行了统计分析，灵敏度和特异性分别为84.2%，93.3＆% 和 92.1% ，95.6%，如图 4 所示。

鉴于人体血液的多样性和个体差异性，如何获取CRC早期快速诊断拉曼特征标志谱是本领域研究的重点。在建立正常人血清主要成分的拉曼基本谱基础上，进一步增加“个体化”拟合因子，同时构建分子拉曼计算模型，通过理论数值模拟与实验分析，开展拉曼分子指纹特征谱的理论和实验研究，构建拉曼早期快速诊断恶性肿瘤研究技术平台，确定恶性肿瘤(乳腺癌和肝癌)快速诊断的拉曼指纹特征标志谱。

7 结论与展望

随着分子生物、内镜影像技术以及激光技术的发展，CRC诊断方法和方式不断改进，新诊断方法和技术不断涌现，为从细胞和分子水平认识结直肠癌类型和癌变进程以及疗效评估提供研究手段和方法。对结直肠癌的早期诊断、定位和分期提高到了一个新的认知水平。尤其是以双光子激发荧光和二次谐波为信号源的多光子显微成像技术非常适合用于组织和细胞的微结构形态和内在成分光谱特性研究，而以拉曼散射效应为基础建立起来的拉曼光谱技术，则可以从物质的分子振动光谱来识别和区分不同的物质结构，能够提供生物组织内在分子组分的详细信息。二者各具优点又能相互补充。无疑，联合多光子显微成像技术与拉曼光谱技术(MPM/RS)并进一步结合内窥镜、微光纤技术将是未来结直肠癌早期无损诊断和治疗评估的重要研究重点和方向，也是本论文作者正在开展的研究工作。进一步的研究将有望从分子水平和细胞水平认识结直肠癌产生、发展的内在机制，建立能够定量表征正常以及不同病程结直肠癌的特征参数，为结直肠癌的早期无损诊断和治疗评估提供参考指标和基础数据，对结直肠癌早期防治具有重要指导意义和参考价值。

图4 (A)正常血清与结直肠癌血清SERS平均光谱对比图;(B，C)正常血清与结直肠癌血清SERS光谱的主成份PC1，PC2，PC3二维散点图［45］Fig.4 (A)Comparison of the mean spectrum for the colorectal cancer serum(blue curve)versus that of the normal serum(red curve)samples.Each spectrum was normalized to the integrated area under the curve to correct for variations in absolute spectral intensity.The shaded areas represent the standard deviations of the means.Also shown at the bottom is the difference spectrum.(B)Plots of the first principal component(PC1)versus the second principal component(PC2)for normal group versus colorectal cancer group.(C)Plot of the first principal component(PC1)versus the third principal component(PC3)for normal group versus colorectal cancer group

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