实时监测溶酶体光损伤诱导细胞凋亡过程中Bax定位的时空变化＊

刘 镭，张真真

(华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室，广东广州 510631)

光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)已成为治疗肿瘤的一项常规手段，具有创伤小、毒性低、选择性和适用性好、可重复治疗、可协同手术提高疗效等多个优点［1-4］。PDT的作用基础是光动力效应，这是一种由氧分子参与的光敏化反应［5-6］。N-aspartyl chlorin e6(NPe6)是一种定位于溶酶体的新一代光敏剂，其光敏化效应能特异性损伤溶酶体，进而引发细胞凋亡［7-11］。

细胞凋亡(apoptosis)是一种普遍的生理现象，它是指在一定的生理或病理条件下，为了维持机体的完整性和自身稳态，各种细胞自发的程序性死亡过程［12］。众多研究表明，Bax是关键的促凋亡因子，能够触发线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。在静息状态下，Bax以单体非激活形式分布在胞浆中，在有凋亡刺激因子诱导的情况下，它会被刺激活化转运到线粒体发挥促凋亡的功能［13-15］。

本研究工作中，为了在活细胞内进一步探讨溶酶体光损伤诱导细胞凋亡的分子机制，我们应用荧光探针GFP-Bax检测Bax在细胞内的动态变化。利用荧光成像在亚细胞水平对Bax转位线粒体的动力学特征进行了实时分析。因而，我们在无损伤、活细胞生理条件下实时、直观、可视地研究了溶酶体光损伤诱导的细胞凋亡过程，获得了Bax在该凋亡信号通路中的动态行为特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及试剂 人类肺腺癌细胞系(ASTC-a-1)由暨南大学医学院药学系提供。小牛血清和培养基 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)购于英国GIBCO公司;转染试剂LipofectamineTM荧光染料Mito Tracker Red及 Acridine Orange(AO)均购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 主要仪器 激光共聚焦扫描显微镜(LSM510/ConfoCor2，Zeiss，Germany)，微型 CO2细胞培养箱(Tempcontrol 37-2 digital，Zeiss，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 质粒及其构建 质粒 GFP-Bax是在全长Bax的 N端融合了 GFP，由 R.J.Youle博士惠赠(National Institute of Heath，Bethesda，MD，USA)。

1.2.2 细胞培养及转染 细胞培养液为 DMEM，添加10%小牛血清(FCS)，100 units/mL青霉素和100μg/mL的链霉素。人肺癌细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，培养24 h左右，使细胞汇合30%-50%，使用Lipofectin试剂转染，步骤如下:首先取两只 Eppendorf管:一只加入 0.2 ～0.4μg 质粒和100μL无血清DMEM培养基;另一只加入2～2.5μL Lipofectin试剂和100μL无血清DMEM培养基，室温静置30～45 min，然后将上述两管轻轻混匀，室温静置10～15 min，用无血清DMEM培养基清洗细胞一次，加0.8mL无血清DMEM培养基于上述的Lipofectin-DNA混合物中，轻轻混匀，加到细胞表面，培养5～24 h后用含小牛血清的DMEM培养基换掉上述转染液，培养24～48 h后即可用于检测。

1.2.3 激光共聚焦扫描显微镜成像检测 实验样品的荧光成像均在Zeiss公司LSM 510型激光共聚焦扫描显微镜上完成，采用Plan-Neofluar 40×/1.3 NA油镜对细胞进行激光共聚焦成像。GFP选用488 nm的氩离子激光作为激发光源，GFP的吸收滤色镜选用BP500-550。

1.2.4 光动力诱导细胞凋亡 细胞在正常条件下避光孵育光敏剂NPe610 h，浓度33μmol/L.然后用PBS清洗光敏剂，更换正常的培养基。激光辐照参数为:半导体激光器(635 nm，NL-FBA-2.0-635)，辐照剂量为4 J/cm2，辐照功率为10 mW/cm2。

1.2.5 数据分析 记录的图像和数据均用Zeiss Rel3.2图象处理软件(Zeiss，Germany)对图象上所选定的区域进行荧光强度定量分析。所有实验均进行了n≥3次重复，同时重复对多个细胞的实验数据进行了分析。

2 结果

2.1 光敏剂NPe6在ASTC-a-1细胞中的定位

图1 光敏剂NPe6的亚细胞定位Fig.1 Localization of NPe6 in ASTC-a-1 cells.ASTC-a-1 cellswere loaded with 33μmol/L NPe6 and 0.5μmol/LAO.NPe6(left panel)and AO fluorescence(middle panel)were visualized by confocal microcopy.The overlay fluorescence image(right panel)of NPe6 and AO indicates that NPe6 is primarily localized in the lysosomes in ASTC-a-1 cells.Scale bar=10μm

我们应用激光共聚焦扫描显微镜来检测光敏剂NPe6的亚细胞定位。AO用来特异性标记溶酶体。结果显示:光敏剂与AO的荧光成像有很好的重合(图1)。证明光敏剂特异性定位于溶酶体。

2.2 溶酶体光损伤诱导Bax转位线粒体

图2 NPe 6-PDT诱导细胞凋亡过程中Bax转位到线粒体的动态变化Fig.2 Dynamics of Bax translocation to mitochondria during NPe 6-PDT-induced apoptosis

为了检测Bax活化后的动态行为，实验中将质粒GFP-Bax转染进ASTC-a-1细胞，通过对GFP的荧光成像追踪Bax在细胞内的运动。同时用Mit Tracket Red标记线粒体形态，根据GFP和 Mit Tracket Red的荧光重叠情况来判别Bax是否转位到线粒体。结果显示，在对照组，凋亡未发生，Bax主要分布在胞浆内，线粒体呈细长的线状或树枝状，散布在细胞质内，可以明显看出Bax没有聚集在线粒体上(图2A)。而凋亡发生后，可以明显看到线粒体分布在细胞核周围，Bax明显定位，GFP和 Mit Tracket Red荧光成像的重叠显示Bax定位在线粒体上，证明溶酶体光损伤诱导了Bax从胞浆内转位到了线粒体(图2B)。通过定量分析线粒体富集区域GFP的荧光强度随时间变化的关系(图 3)，也证实在此过程中，Bax逐步转位到了线粒体。动力学特征显示，一旦凋亡发生，Bax迅速转位线粒体，在30 min内便能完成。

图3 NPe 6-PDT诱导细胞凋亡过程中Bax转位到线粒体量化分析Fig.3 Quantification of Bax translocation to mitochondria after NPe 6-PDT treatment.Each curve represents an average of 12-15 cells obtained from 3 independent experiments.Bax-GFP fluorescence intensity in each curve at the first time point is normalized to 100 and the time of the onset of Bax-GFP redistribution is set to zero.Data represent the mean±SEM

3 结论

近年来，我们实验室致力于发展单分子实时检测手段在活细胞内研究蛋白分子的动态变化［16-17］。本研究中，我们在活细胞内实时监控溶酶体光损伤诱导细胞凋亡过程中Bax亚细胞定位的动态变化。结果表明，光敏剂NPe6特异性定位于溶酶体(图1)。溶酶体光损伤后约170 min，Bax开始转位到线粒体，其过程非常迅速，在30 min之内便大量聚集在线粒体上(图2，图3)。该研究结果实时动态地展示了细胞凋亡过程中Bax的时空变化过程，为研究靶向溶酶体的光动力治疗提供理论参考。

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