西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究＊

马金柱，王化磊，郑学星，吴红霞，赵永坤，王铁成，杨松涛＊，夏咸柱，3＊

(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319;2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122;3.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus，WEEV)能够引起人畜共患急性传染性脑炎，呈现病死率高，病愈后多留有神经系统后遗症等显著特点，已经引起世界各国高度重视，被列为二类生物恐怖试剂［1-4］。WEEV最早发现于1930年，从美国加州默克郡的马脑内被分离［5］。之后，加拿大、美国和墨西哥等国都有WEEV发生报道。我国于1990年分别从新疆乌苏县的一组赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离出WEEV［6］。WEEV主要以蚊虫形式传播，也可通过气溶胶形式传播，加之生态环境和国际间交流频率不断增加给WEEV传染提供了可能，导致WEEV预防任务日益加重。如今，人类主要利用灭活和弱毒疫苗预防本病，但它们存在许多缺点，临床应用受限，严重缺乏WEEV高效疫苗研究［7］。研究显示 WEEV 编码 C、E3、E2、6K 与 E1 结构蛋白，它们之间能以特定形式组装成WEEV病毒体，具有较强的免疫原性，可引起机体产生细胞免疫和体液免疫［2，8-10］。因此，本研究构建成重组真核表达载体pcDNA3.1-C-E3-E2-6k-E1，使其用细胞或机体表达WEEV病毒样粒子而模拟自然状态病毒体，研究该重组载体作为核酸疫苗的免疫原性，以为WEEV新型疫苗研究提供重要参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

细胞因子ELISA检测试剂盒与小鼠CD8、CD4、CD3流式单克隆抗体购于RD公司;Qiagen公司质粒提取试剂盒;核酸内切酶 Hind III和 Not I、T4连接酶、DNA Marker、HRP标记的羊抗鼠 IgG和羊抗鼠FITC标记二抗均购自大连宝生物工程有限公司;Invitrogen Lip 2000转染试剂;鼠源WEEV单克隆抗体购于millipore公司，NEB公司高保真DNA聚合酶。

1.2 细菌、质粒、细胞与实验动物

感受态细胞 (E.coli BL21)，pcDNA3.1载体与pVL1393-C-E3-E2-6k-E1(载体上含有C-E3-E2-6k-E1全基因序列，简写pVL1393-C-E)重组质粒及293T细胞由军事医学科学院军事兽医研究所保存。动物实验采用洁净级BALB/c小鼠，小鼠为5-6周龄雌性小鼠，体重为10-15 g，由长春生物制品所提供。

1.3 重组表达载体构建与鉴定

1.3.1 引物设计 根据Genbank中编码全基因CE3-E2-6k-E1序列，利用DNAStar软件设计一对扩增编码全基因特异性引物，引物两端分别加上酶切位点Hind III和Not I的碱基序列(下划线所示)，经分析引物具有很好的特异性。引物序列如下:

将以上序列邮寄上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成。

1.3.2 目的基因获得 以提取重组质粒pVL1393-C-E为模板PCR扩增3711 bp片段。PCR反应体系组成如下:DNA 模板 1μL，10 × PCR 缓冲液2μL，上游 引 物 1μL(25μmol/L)和 下 游 引 物 1μL(25μmol/L)，Phusion DNA 高保真聚合酶 0.2μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，去离子水13.8μL，总反应体系为20μL。反应热循环参数为:95℃预热3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 3 min，30 个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应结束后，取3μL产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳。观察并记录结果。

1.3.3 酶切与连接及转化 将纯化后的PCR产物和 pcDNA3.1载体双酶切。酶切体系:10×BSA 5μL，Hind III 1μL，Not I 1μL，DNA 12μL，10 × K 缓冲溶液 2.5μL，ddH2O 28.5μL，混匀后，37 ℃ 水浴中酶切3 h。纯化后酶切产物连接体系为:SolutionI 2.5μL(含 T4 连接酶)，DNA 5.5μL，载体 2.0μL，16℃连接过夜。最后，按热休克方法对连接产物进行转化。

1.3.4 重组表达载体的鉴定 将上述转化菌过夜培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒，采用酶切和基因测序方法鉴定重组质粒，阳性重组质粒命名为pcDNA3.1-C-E，获得的重组菌命名为 E.coli BL21 pcDNA3.1-C-E。

1.4 重组质粒转染

采用含10%小牛血清的DMEM完全培养基培养293T细胞，待细胞覆盖70%-80%培养孔底壁时，按照转染试剂说明书将重组质粒pcDNA3.1-C-E转染到293T细胞，转染后，在37℃、5%CO2条件下细胞培养48～72 h后，细胞和细胞上清液分别用于间接免疫荧光(indirect immunofluorescence，IIF)和电镜检测，确定WEEV病毒蛋白或病毒样粒子是否表达。细胞培养完毕后，吸掉上清，加入80%预冷丙酮，-20℃固定2 h，PBS洗涤后，加入一抗(WEEV单克隆抗体)37℃反应2 h，PBS洗涤后，加入用0.1%伊文斯兰稀释的二抗(羊抗鼠FITC标记)，37℃反应1 h，PBS洗涤后荧光显微镜下观察。电镜检测病毒样粒子时，样品用磷钨酸染色。

1.5 动物免疫

取健康雌性BALB/c小鼠24只，随机分成3组，每组8只。第1组和第2组分别是PBS免疫组与pcDNA3.1免疫组，第3组是重组质粒pcDNA3.1-CE 免疫组，每组分别注射 100μL PBS、100μL pcDNA3.1 质粒(1μg/μL)与重组质粒 pcDNA3.1-C-E 100μL(1μg/μL)。免疫前 72 h 于小鼠股四头肌肌肉多点注射布比卡因，然后在相同部位进行免疫。小鼠共免疫3次，两次免疫间隔时间为3 w。在每次免疫后第21 d给小鼠采血，用于T细胞、细胞因子和抗体水平检测。

1.6 免疫指标检测

1.6.1 CD4+T细胞和CD8+T细胞比例检测 在小鼠2免后第21 d，随机取每组小鼠3只，眼眶采血100μL/只，以阿氏液(ACD)作为抗凝剂。用0.83%氯化铵裂解红细胞，PBS洗涤后，用10%小鼠血清封闭免疫细胞，然后，将细胞与小鼠CD3+分子单抗(CY3-PE标记)、CD4+分子单抗(FITC标记)和CD8+分子单抗(PE标记)4℃结合30 min，PBS洗涤后，用流式细胞仪分析CD4+T细胞和CD8+T细胞比例。

1.6.2 细胞因子浓度测定 取二免后第21 d各组小鼠血清，用细胞因子ELISA检测试剂盒测定血清中IL-2、IL-4和IFN-γ浓度。根据标准品的浓度和OD450nm值，绘制标准曲线，计算待检测样品中相应细胞因子的含量，用 SPSS10.0统计软件进行统计学分析。

1.6.3 IgG抗体水平测定 利用原核系统表达WEEV的E2蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法，检测每次免疫以后小鼠血清中E2蛋白抗体水平。封闭液采用1%BSA，底物为 TMB，终止液为2 mol/L H2SO4，E2 蛋白包被浓度是 10μg/mL，一抗为待检小鼠血清，二抗为HRP标记羊抗鼠IgG;一抗37℃反应2 h;二抗37℃作用1 h;最后，以450 nm波长测吸光度。以恰好样品OD值≧阴性血清样品的OD值+3S(S为标准方差)临界值时，对应血清稀释度为该样品血清效价。

2 结果

2.1 目的基因扩增

以提取的pVL1393-C-E重组质粒为模板，经PCR扩增得到一条为3711 bp的条带，1%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1所示。

图1 C-E基因的PCR产物Fig.1 The PCR product of C-E gene

2.2 重组质粒的鉴定结果

pcDNA3.1-C-E质粒采用 Hind III和 Not I双酶切后，经过琼脂糖电泳，紫外光下可见插入片段与目的片段大小相符，酶切之后得到约为3700 bp和5500 bp左右两条带，如图2所示。目的基因测序结果与GenBank上NC-003908.1基因序列相比较同源性为100%，说明目的片段连接正确。

2.3 重组质粒转染效果鉴定

图2 pcDNA3.1-C-E的酶切鉴定Fig.2 The enzyme digestion of pcDNA3.1-C-E

在转染293T细胞培养48-72 h后，IIF检测结果表明pcDNA3.1-C-E转染的293T细胞中能清晰观察到绿色荧光，并且荧光强度较强，相反，pcDNA3.1转染的293T细胞和正常培养293T细胞中未见到绿色荧光，说明pcDNA3.1-C-E能在细胞中表达病毒结构蛋白，结果如图3所示;另外，电镜检测结果表明转染后的293T细胞中和细胞培养上清液中都能见到球形病毒样粒子(VLP)，具有囊膜结构，VLP直径在50～70 nm之间，与WEEV大小相符，这进一步说明重组质粒不仅能在细胞中表达病毒结构蛋白，而且病毒蛋白能够组装成病毒体结构释放到胞外，结果如图4所示。

2.4 CD4+T细胞和CD8+T细胞比例

用流式细胞仪检测单抗标记的CD3+T细胞1×104个，然后分析CD4+T细胞/CD8+T细胞比例。结果表明实验组(pcDNA3.1-C-E载体免疫)小鼠CD4+T细胞/CD8+T细胞比例明显高于对照组，差异均显著(P＜0.05)，图5为CD4+T细胞和CD8+T细胞比例统计分析结果。

图4 电镜检测结果Fig.4 The result of detection of the electron microscopy

图5 CD4+T细胞和CD8+T细胞比例统计分析Fig.5 The statistics of CD4+T/CD8+T cell

2.5 细胞因子浓度测定

细胞因子测定结果表明2免后第21 d实验组小鼠血清中IL-2、IL-4及IFN-γ浓度(pg/mL)都分别明显高于pcDNA3.1免疫组和 PBS-对照组，差异极显著(P＜0.01)，说明 pcDNA3.1-C-E 载体具有很强的免疫原性，能够刺激小鼠免疫细胞活化，产生高水平细胞因子，结果见图6-8所示。

图6 小鼠血清中IL-2含量(M±SD)Fig.6 Concentrations of IL-2 in mice sera(M ± SD)

2.6 IgG水平检测结果

图7 小鼠血清中IL-4含量(M±SD)Fig.7 Concentrations of IL-4 in mice sera(M ± SD)

图8 小鼠血清中IFN-γ含量(M±SD)Fig.8 Concentrations of IFN-γ in mice sera(M ± SD)

在每次免疫后第21 d采集小鼠血液，分离血清，将每份血清1∶2倍稀释后，再做2倍倍比稀释(每组3 只小鼠血清)，即做 1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 与 1∶64 倍稀释。用间接ELISA方法检测血清中E2蛋白的IgG水平。结果显示1免后实验组小鼠E2蛋白IgG抗体开始产生，并随着免疫时间延长，抗体效价逐渐上升，3免后第21 d抗体效价可达到1∶16，结果见图9所示。表明pcDNA3.1-C-E能够明显刺激机体产生体液免疫。

图9 免疫鼠血清中E2蛋白IgG抗体效价Fig.9 IgG titres of sera from the immunized mice

3 讨论

WEEV是一类具有囊膜RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属成员，其致病性较强［11，12］。

自发现WEEV以来，已有80多年历史，在此期间，人们对WEEV做了大量研究，取得了很多重要科研成果，包括WEEV地理位置分布、传播途径、病毒形态结构、基因组结构及病毒增殖过程等［13-16］，这对与人类深入认识和了解WEEV病毒生物学特性和致病机理及其制定预防该病毒策略具有重要意义。目前，人类尚未完全认识和掌握WEEV，尚存很多需要人类花费更长时间急需解决的重大问题，包括WEEV如何通过血脑屏障进入脑组织，进入之后又是怎样破坏脑组织引起脑炎，在此过程中，为何小胶质细胞以及其他免疫细胞和免疫分子不能清除WEEV，WEEV与它们之间发生了怎样相互作用。这些问题能否被解决直接关系到将来WEEV有效预防与治疗。因WEEV传染性强，致死率高且为人兽共患，一直受到国际社会的高度重视。

近些年，WEEV传统疫苗研究较多，新型疫苗研究较少，尚需新型高效WEEV疫苗研制。Pedersen等人制成WEEV的弱毒苗、Wu等人［17］用腺病毒 Ad5-WEEV(含有E3-E2-6K-E1结构蛋白)构建成核酸疫苗和 Atasheva等人［4］用 Sindbis virus(SINV)/WEEV制成嵌合疫苗都具有很好免疫原性，但它们存在各自缺点，应用受限，所以WEEV疫苗研究仍是人类现在面临一个重要难题，也是有效预防WEEV关键所在。研究表明VLP与自然病毒体具有相似形态和空间结构，能够有效模拟自然病毒体的抗原表位，尤其是VLP不含核酸，相对更加安全、副作用小，所以预测VLP将来有望成为最具有发展潜力的新型疫苗［18］。因此，本研究对 pcDNA3.1-C-E 载体进行了免疫原性研究。结果表明该重组质粒被转染到293T细胞后，可在细胞中表达成病毒样粒子(VLP)。动物实验表明重组质粒pcDNA3.1-C-E作为核酸疫苗能改变小鼠体内CD4+T细胞和CD8+T细胞正常比例，能有效活化CD4+T细胞，CD4+T细胞能够促进B细胞活化，加上免疫鼠血清中产生WEEV抗体，说明重组质粒能够刺激小鼠产生体液免疫;另外，免疫小鼠产生高水平 IL-2、IFN-γ 和 IL-4，其中 IL-2、IFN-γ主要由Th1细胞产生，IL-4主要由Th2细胞产生，提示重组质粒能够促进细胞免疫活化。由于WEEV属于高危病原，对其操作要求实验环境较高，所以本研究没有进行攻毒实验来确定重组质粒对WEEV保护效果。尽管如此，研究结果初步说明重组质粒作为核酸疫苗具有较强的免疫原性，为今后WEEV新型疫苗研究提供了重要参考。

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