斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测＊

盛力翔，冯德峰，罗世锋，吴秀山，戴 国，莫小阳

(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，湖南长沙 410081)

作为严重影响人类健康的一类疾病，遗传性心脏病由一系列调节心脏发育的基因及其相关基因的突变而引起。利用模式动物来研究这些基因的功能是前人验证的有效的方法。而且斑马鱼作为模式生物具有卵透明、胚胎发育快、心脏、体节清晰、其整个发育过程可在解剖镜下进行观察、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短、繁殖力强等众多优点。另外，斑马鱼的胚胎并不需要完全依赖于功能正常的心脏血管系统就能生存，即使在一个完全缺乏血液循环的环境中，它们也可以通过被动呼吸得到足够的氧而生存，并以相对正常的外形继续发育几天的时间，这一点尤其适用于研究那些因遗传原因或实验原因导致心脏血管系统出现严重缺陷的动物，因而被广泛运用于胚胎学和遗传学的研究。

Fbxl5(F-box and leucine-rich repeat protein 5)作为F-box家族蛋白中的一员，在心脏、脑、肾脏等器官中广泛表达［1］，含有5个结构域，一个F-box位于N端，另外还有3个LRR以及1个LRR-CC结构域。F-box蛋白是SCF复合体4个核心亚基之一，具有底物识别特异性［2］。SCF复合体其他3个亚基(Skp1和Cdc53即cullin和RBX1)共同组成一个一般性骨架，F-box蛋白的底物识别特异性机理在于:不同的F-box蛋白分别与这个一般性骨架结合从而达到识别不同的底物的目的。F-box蛋白家庭是一个非常庞大的家族:据估计，在拟南芥中，F-box蛋白至少有700种［3］。F-box蛋白不仅存在于像人体、酵母、果蝇、线虫以及各种哺乳动物等真核生物中，也存在于原核生物中［4］。最近的研究表明，其中线虫F-box蛋白最多，共有 326 个［5］。

Fbxl5基因位于斑马鱼第23号染色体，属F-box家族成员，含11个外显子和10个内含子。Fbxl5基因编码的蛋白质为酸性蛋白质，包含一个F-box结构域和四个LRR结构域。F-box蛋白是在泛素-蛋白酶体途径降解蛋白质的过程中具有底物识别特性的一类蛋白质家族。泛素-蛋白酶体途径在胚胎心脏发育过程中发挥重要作用。研究斑马鱼Fbxl5基因在泛素-蛋白酶体途径介导的胚胎心脏发育中的作用［1-7］。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.1.1 菌种、克隆表达载体 大肠杆菌 E.coli Rosseta、E.coli BL21菌株，由本实验室保种;pMD18-T克隆载体购自大连宝生物公司;pET-28a空表达载体菌种由本实验室提供。

1.1.2 酶及主要材料试剂 限制性内切酶ApaⅠ、SacⅠ、EcoR I和 Sal I，Taq DNA 聚合酶，10 × Loading buffer购自深圳晶美公司;连接酶购自大连宝生物公司;RNase购自Sangon公司;UNIQ-10柱式DNA胶回收纯化试剂盒购自上海生工公司;柱式DNA胶回收纯化试剂盒购自TIANGEN;质粒提取试剂盒(离心柱型)购自OMEGA;Ni-IDA凝胶柱蛋白纯化试剂盒购自上海生工公司;蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)等购自上海生工公司;弗氏佐剂购自Sigma公司。新西兰大白兔购自中南大学湘雅附一医院。基因芯片分析送到北京博奥生物有限公司进行。

1.2 Z-Fbxl5引物设计与合成

用 Primer Premier 5.0软件设计，根据巢式PCR的原理和ncbi网站提供的Fbxl5基因的序列设计引物。运用巢式PCR先扩增出斑马鱼Fbxl5基因的前后片段再用搭桥PCR扩增全长。

1.3 Z-Fbxl5基因扩增及克隆

1.3.1 Z-Fbxl5-qian片段克隆入T载体及鉴定提取两天时期的斑马鱼胚胎 Total RNA［8］，反转成cDNA，进行巢式PCR扩增。先用引物1以进行PCR扩增，再以所得产物为模板，再用引物2扩增。将扩增出片段克隆入pMD18-T载体，选取目的片段中酶切位点ApaⅠ和载体上酶切位点SacⅠ进行双酶切检测，之后送生物公司进行测序鉴定。

1.3.2 Z-Fbxl5-hou片段克隆入T载体及鉴定 用引物3通过PCR扩增出Z-Fbxl5-hou片段(1437 bp)，目的片段经纯化回收后克隆入pMD18-T载体，筛选出阳性单克隆并送去生物公司进行测序鉴定。

1.3.3 搭桥PCR扩增全长 分别以构建成功的pMD18-T-Z-Fbxl5-qian和pMD18-T-Z-Fbxl5-hou片段为模板。用Pfu酶PCR大量扩增出pMD18-T-ZFbxl5-qian和pMD18-T-Z-Fbxl5-hou片段并纯化。测定回收片段浓度，将其等浓度混合均匀后作为模板，用引物4扩增CDS引物搭桥PCR扩增全长(2135 bp)。胶回收目的片段后，克隆入pMD18-T载体，酶切检测和测序鉴定筛选阳性克隆。

1.4 原核表达质粒pET28a-Z-Fbxl5的构建

从NCBI数据库检索出斑马鱼Fbxl5基因的相关信息，先用SMART软件分析其蛋白(XP_695044.5)结构域，再对其进行亲水性疏水性分析。选取亲水性强且含结构域少的一段(420 aa-594 aa)作为抗原，以构建成功的pMD18-T-Fbxl5质粒为模板，用带酶切位点引物5进行PCR扩增出目的片段。

将大量扩增的目的片段纯化回收后，克隆入原核表达载体pET28a，双酶切(EcoR I和Sal I)筛选出阳性克隆，并送生物公司进行测序鉴定。

1.5 Z-Fbxl5融合蛋白的诱导表达

将构建好的pET28a-Z-Fbxl5原核表达载体转入Rosseta感受态细胞中，挑单菌落接种在(50 mg/L氨苄青霉素和75 mg/L氯霉素)液体培养基中，次日保种，并筛选鉴定出阳性菌落。然后直接去阳性克隆菌于100mL锥形瓶中37℃培养12 h左右，次日以1∶50扩大培养，当菌液 OD600达 0.5 至 0.6 时加入IPTG诱导。

1.6 Z-Fbxl5融合蛋白的纯化

通过各时段取样比较，选取0.2 mmol/L IPTG浓度诱导8 h的进行大量诱导。离心收集菌液，液氮反复冻融PBS重悬后超声裂解，离心取上清。4℃下与经Binding Buffer漂洗活化后的Ni-IDA凝胶柱结合，Washing Buffer洗去杂蛋白，Elution Buffer洗脱目的蛋白，获得纯化的His-Fbxl5融合蛋白，-80℃保存备用。

1.7 Z-Fbxl5 的抗体制备

选取成年健康新西兰大白兔，耳缘静脉取血约5mL，制备免疫前正常血清，作为阴性对照。将纯化得到的His-Fbxl5蛋白质按体积比1∶1与弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)在注射器中推成乳剂后，对大白兔进行背部皮下免疫注射，分散15-20个点;注射速度尽量慢而均匀，其分布位置则尽量均匀分布于大白兔身体背部的各个部位;在第14天、第21天、第28天再将溶于0.5mL生理盐水中的0.5 mg抗原蛋白与弗氏不完全佐剂按体积比1∶1在注射器中推成乳剂，进行背部皮下多点注射。第40天主动脉取血。兔血放在4℃冰箱静置过夜，随后3000 r/min离心10 min，取血清加入 0.01%NaN3分装保存于-80℃。

1.8 Z-Fbxl5兔多克隆抗体检测

收获免疫兔血清，用pET-28a-Fbxl5转化BL21菌株诱导表达的总蛋白，SDS-PAGE电泳跑胶，用兔血清进行Western bolt检测，设置的抗体浓度分别为1∶500、1∶1000。

1.9 Z-Fbxl5基因在斑马鱼胚胎与成体组织的表达

1.9.1 Fbxl5基因在斑马鱼胚胎中的表达 收集斑马鱼不同时期胚胎，共提取18个不同时期胚胎蛋白样品。用Bradford法测定浓度后，用自制抗体检测Fbxl5基因的表达。

1.9.2 Fbxl5基因在斑马鱼成体组织的表达 提取斑马鱼成体各种组织蛋白:肝脏、脑、心脏、肾、鳃、肌肉、眼、肠、鳍，用自制的Z-Fbxl5兔多克隆抗体检测这些组织中Fbxl5蛋白的表达情况。

1.9.3 基因芯片分析Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异 收集斑马鱼1细胞期胚胎注射Fbxl5-MO，并同时注射Std-MO作为对照，培养至2天时，挑出畸形胚胎60颗左右，同时取60颗Std-MO胚胎作为对照。用Trizol法提取total RNA，甲醛变性胶进行RNA电泳，并测浓度。获得公司送来基因芯片结果后对其进行统计学分析。

2 结果

2.1 Z-Fbxl5基因表达载体的构建

2.1.1 Z-Fbxl5-qian片段 将以斑马鱼cDNA文库为模板进行PCR扩增纯化出的Fbxl5基因片段克隆到一级载体pMD18-T中，将扩增出片段(719 bp)克隆入pMD18-T载体，选取目的片段中酶切位点ApaⅠ和载体上酶切位点SacⅠ进行双酶切检测(片段大小为633 bp)，之后送生物公司进行测序鉴定，结果如图1。

图1 Z-Fbxl5-qian片段PCR及pMD18-T载体酶切检测和测序结果Fig.1 Enzyme detection and sequencing result of Z-Fbxl5-qian fragment by PCR and vector pMD18-T

2.1.2 Z-Fbxl5-hou片段 PCR扩增出Z-Fbxl5-hou片段，筛选出阳性单克隆并送去生物公司进行测序鉴定，结果如图2。

2.1.3 搭桥 PCR扩增 Z-Fbxl5全长片段 按照1.3.3方法所说通过搭桥PCR扩增出Z-Fbxl5的全场片段，结果图3所示。

2.2 原核表达质粒pET-28a-Z-Fbxl5的构建

按照1.4所说的方法构建了Z-Fbxl5的原核表达质粒，结果如图6和7所示。

2.3 Z-Fbxl5融合蛋白的诱导表达和纯化

图2 Z-Fbxl5-hou片段PCR及pMD18-T载体测序结果Fig.2 Enzyme detection and sequencing result of Z-Fbxl5-hou fragment by PCR and vector pMD18-T

图3 Z-Fbxl5全长搭桥PCR及pMD18-T载体测序结果Fig.3 Sequencing result of Z-Fbxl5-full fragment by bridge PCR and vector pMD18-T

图4 pMD18-T-Z-Fbxl5质粒示意图Fig.4 Schematic representation of pMD18-T-Z-Fbxl5

图5 pET-28a-Z-Fbxl5的质粒示意图Fig.5 Schematic representation of pET-28a-Z-Fbxl5

图6 pET-28a-Z-Fbxl5片段PCR扩增图Fig.6 Fragment of pET-28a-Z-Fbxl5 by PCR amplification

图7 pET-28a-Z-Fbxl5质粒的酶切检测与测序结果Fig.7 Enzyme detection and sequencing result of pET-28a-ZFbxl5 plasmid

当IPTG浓度为0.4 mmol/L，37℃诱导4 h后，目的蛋白(分子量约为24 kD，与预期大小一致)大量表达(结果如图8)。样品进行超声处理后发现蛋白主要在沉淀中表达，因此先将包涵体溶解后，再用His柱子纯化目的蛋白。

三次洗脱液中目的蛋白含量第二次浓度最高，接着按照上述条件大量诱导纯化出目的蛋白(如图9)。

2.4 Z-Fbxl5兔多克隆抗体检测

选取适龄的健康新西兰大白兔，用适量斑马鱼Fbxl5融合蛋白溶液(约1 mg)加入等体积弗氏完全佐剂充分混匀，分15个点对兔子进行皮下注射进行第一次免疫;两周后，换用弗氏不完全佐剂每周进行加强免疫，共计加强免疫三次。收获抗血清，用IPTG诱导的菌液总蛋白检测特异性，诱导前血清为对照(图10)。结果抗体效价为1∶1000时杂交信号非常明显，而且背景较少，结果如图10所示。

2.5 Z-Fbxl5基因在斑马鱼胚胎中的蛋白表达

收集斑马鱼不同时期胚胎，共提取18个不同时期胚胎蛋白样品。用Bradford法测定浓度后，用自制抗体检测Fbxl5基因的表达。结果图11所示，由图可知Fbxl5是一个早期表达基因，在1细胞期就开始表达，而且表达量较高，随着胚胎发育开始表达量略有下降，大至从囊胚期开始又回升，至24 h表达量最低，之后又开始回升。总之在胚胎发育中Fbxl5一直是较稳定表达，可见它在早期胚胎发育中有很重要的作用。

图8 His-Z-Fbxl5融合蛋白的表达Fig.8 The expression of His-Z-Fbxl5 fusion protein

图9 His-Z-Fbxl5的融合蛋白大量纯化Fig.9 Purification of His-Z-Fbxl5 fusion protein

2.6 Z-Fbxl5基因在斑马鱼成体组织的蛋白表达

提取成体斑马鱼多组织蛋白，用自制多克隆抗体进行Western blot检测(如图12)发现Fbxl5在斑马鱼成体脑、心脏、肾、鳃、肌肉和肠中表达，其中在脑、心脏、肾和鳃中表达较强，而在肌肉、肠中表达较弱，而且条带单一，说明所制备抗体特异性好。

图10 斑马鱼Fbxl5抗体效价检测Fig.10 The results of the titers of Z-Fbxl5 antibody

图11 Fbxl5基因在斑马鱼胚胎中的蛋白表达Fig.11 The protein expression of Fbxl5 in embryo of Zebrafish

图12 斑马鱼多组织蛋白Western blot结果(β-actin为内参)Fig.12 The results of Western Blot analysis of tissue protein of Zebrafish.(β-actin was used as control)

2.7 基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异

收集斑马鱼1细胞期胚胎注射Fbxl5-MO，并同时注射Std-MO作为对照，培养至2天时，挑出畸形胚胎60颗左右，同时取60颗Std-MO胚胎作为对照。用Trizol法提取total RNA，甲醛变性胶进行RNA电泳，并测浓度。结果如右图13所示:RNA条带清晰，28S比18S rRNA条带亮度接近2∶1，质量合格，总量足够，可以进行芯片实验。用干冰保护样品，将其送往北京博奥生物有限公司进行基因芯片分析［9］。

得公司送来基因芯片结果后，对其进行统计学分析。结论显示共检测基因14295个，其中具有差异性表达的基因有1874个。相对于Std样品而言，注射了斑马鱼Fbxl5基因Morpholino的胚胎中，表达上调的基因有956个，包括心脏标志基因tnc，vmhc及心脏发育相关基因sox21b，mylz3，sox4a等;表达下调的基因有918个，包括心脏标志基因myl7及心脏发育相关基因mif，sox4b等。现列举了几个基因如表1所示。

图13 RNA电泳图Fig.13 The electrophoretogram of RNA

表1 Fbxl5-MO和Std胚胎样品基因芯片分析部分结果Tab.1 Gene chips analysis result of embryo sample from Fbxl5-MO and Std

3 讨论

作者进一步研究了Foxp4的另一个候选基因Fbxl5在胚胎发育中的时空表达，并利用基因芯片分析了敲低Fbxl5的表达后对其它基因表达的影响。

目前对Fbxl5功能的报道并不多，为了进一步研究Fbxl5基因的功能，本文通过生物信息学方法，选取编码Fbxl5蛋白中亲水性较高的一段核苷酸序列进行PCR扩增，构建了可在原核细胞中表达斑马鱼Fbxl5基因的重组质粒pET-28a-Fbxl5，将诱导表达的His-Fbxl5融合蛋白对新西兰大白兔进行免疫，制备斑马鱼的多克隆抗体。对免疫血清的特异性和效价进行了检测，Fbxl5多克隆抗体的制备为进一步探索Fbxl5的功能奠定了基础。

在成功制备该基因多克隆抗体之后，作者检测并分析了Fbxl5在斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况。发现Fbxl5蛋白在胚胎发育中一直较稳定表达，1细胞期表达较多，随后略有下降，囊胚期开始又回升，之后除24 h表达量较低外，其余时期均较稳定表达。斑马鱼成体中，Fbxl5蛋白在脑、心脏、肾、鳃、肌肉、肠中表达，其中鳃中表达最强，而在肌肉，肠中表达较弱，有此有推测该基因参与了有机体多种器官发育。

基因芯片又叫DNA微阵列、DNA芯片、寡核苷酸阵列，通过检测杂交信号来实现对生物样品并行、快速、高效地检测或医学诊断。利用该技术结合RNA干扰来探寻信号通路，是近年来非常流行、有效的手段。本文利用Fbxl5-MO敲低Fbxl5在斑马鱼胚胎中的表达，通过基因芯片分析48 h的Fbxl5-MO胚胎和对照胚胎样品中mRNA的含量差异。结果表明，斑马鱼14295个基因中共检测到差异性表达的基因1874个，包括心脏标志基因tnc、vmhc、myl7等。

总之，本节对心脏发育候选基因Fbxl5开展的一些工作，包括该基因多克隆抗体的制备、表达分析以及基因芯片结果，为本室后期的研究提供了有利的信息。尤其是基因芯片结果揭示出在敲减Fbxl5蛋白后，对心脏标志基因 tnc、vmhc、myl7等产生了影响，为后期弄清Fbxl5基因调控心脏发育的信号途径与分子机制奠定了基础［8-11］。

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