福建省部分地区马铃薯致病疫霉群体遗传多样性分析＊

祝 雯，付海静，杨丽娜，陈庆河，翁启勇，詹家绥*

(1.福建农林大学植物病毒研究所，福建福州 350002;2.福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州 3500013)

病原物致病性或寄主的抗病性是指在特定时间、地理条件下某一特定的病原物群体同某一特定的寄主之间的关系［1］。植物病原物群体结构的变化直接影响着植物病害的发生和流行。通过对病原菌群体遗传结构的研究，推测病原物的进化机制，从而有针对性选择病害防治手段，为最终实现延长抗性品种使用寿命、降低植病防治的环境和生态成本及可持续性植病防治奠定基础［2］。在二十世纪80年代之前，致病疫霉遗传多样性低，群体结构比较单一。从对来自20个国家的300多个疫霉菌株进行同功酶和脱氧核糖核酸指纹鉴定发现，交配型为A1的USA-1基因型占绝对优势［3］。自1984年首次在欧洲检测到A2交配型后［4］，A2交配型又先后在许多国家发现。A2的出现意味着可以产生卵孢子，并通过有性繁殖进行基因重组，形成新的适应性更强的菌株［5-6］。在欧洲北部地区及墨西哥部分地区马铃薯致病疫霉菌群体结构日趋复杂［3，7-9］。在中国自从1996年报道A2交配型首次在中国河北发现，人们逐渐开始关注我国致病疫霉菌的群体遗传结构，陆续报道了该病原物在部分省市地区的群体遗传多样性［10-20］。但其中所涉及的群体菌株大都来自2008年以前。

晚疫病是限制我国马铃薯产量的重要因素，在我国4个栽培区域即北方一季作区、中原二季作区、南方冬作区、西南混作区均有发生。福建省属于南方冬作区，近年来晚疫病在福建省的发生和流行日趋严重。本文分析福建省福州市、长乐市和漳州市三个地区的马铃薯致病疫霉菌的群体遗传结构特征，明确马铃薯致病疫霉遗传多样性的空间分布，以探索其可能的形成机制。

1 材料与方法

1.1 样本的采集及病菌的分离培养、保存

2010年3月-4月福建省马铃薯晚疫病流行期，在发病区任选一块田块，随机选择发病植株，病株间隔2米以上，每个病株上选择单个病斑的病叶。无菌水冲洗叶片表面后，保湿培养12～24 h。用接种针挑取单根菌丝，接种于含有抗生素(氨苄青霉素100 mg/L;利福平10 mg/L)的选择性黑麦培养基上，黑麦培养基配置是将20 g黑麦种子浸泡12 h，匀浆机粉碎，60℃水浴浸提3 h，四层纱布过滤，滤液定容至1 L，121℃高压20 min。18℃避光培养7～10 d。纯化的菌株接种于黑麦培养基培养，13℃避光长期保存菌株。

1.2 马铃薯晚疫病菌基因组DNA的提取和SSR分析

收集在黑麦液体培养基中培养10 d的菌丝体，冷冻干燥并粉碎后使用TAKARA公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 试剂盒提取基因组 DNA。选用 8 对引物 Pi02、Pi04、Pi16、Pi26、Pi56、Pi66、Pi33［21］，Pi4B［22］，按 照 Lees 等 报 道 的 的 方法［21］扩增基因组 DNA，25μL 反应体系，模板 1μL DNA，1.0 unit Taq DNA polymerase，200 mmol/L dNTP，10 pmol/L 引物，2.5 mmol/L MgCl2，加无菌超纯水补足至25μL。PCR热循环条件为:95℃预变性2 min;95℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环33次;72℃延伸5 min。扩增反应在PCR扩增仪(AB 2720 Thermal Cycler)上进行。PCR产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染方法［23］为将胶块放入含有0.1%硝酸银，10%乙醇的染色液中染色5 min，显影剂(2%NaOH，0.5%甲醛，甲醛为临用前加入)显色，100 r/min摇动10～15 min，充分染色至条带明显。

1.3 统计与分析

不同SSR引物的扩增结果视为不同的基因座，同一引物的不同扩增片段视为不同等位基因。菌株的基因型按每一基因座的等位基因种类进行划分，相同基因型的菌株是指它们的8个基因座都含有完全一致的等位基因。群体内的遗传多样性同时用基因座间的平均观察杂合度和平均期望杂合度来衡量。每个基因座的观察杂合度等于该基因座杂合体占群体内所有个体的比例。每个基因座的Nei氏遗传多样性用期望杂合度来衡量［24］。群体间遗传结构的差异性则分别用Nei氏遗传距离［25］、Nei氏遗传相似度［25］，列表卡方［26］和群体间遗传分化程度(FST)来衡量［27］。当具有不同等位基因频率的亚群体混合时，混合群体的平均杂合度会减低，即使亚群本身处于哈迪-温伯格平衡，而平均杂合度会减低程度与群体间遗传分化程度成正相关［27］，用数学公式表示为:

在公式(1)中，FIT为总群体偏离哈迪-温伯格的程度，而FIS则是亚群体内的平均偏离哈迪-温伯格平衡的程度。如果继续假设亚群体间的基因流和遗传漂变已处于相对平衡阶段，则根据岛屿模式，群体间单一世代的平均有效基因流量(Nm)可以用混合群体的平均杂合度会减低程度来估算，用公式表示为:

等位基因频率、基因多样性，群体间的遗传距离及相似度，群体间遗传分化程度及基因流量等群体遗传学参数用 POPGENE321.32版软来估算［28］。

2 结果与分析

2.1 致病疫霉菌的分离

2010年3月-4月从福建省长乐、漳州和福州三地采集的病叶中共分离得到95株马铃薯致病疫霉菌株，菌株的采集地和各地采集的菌株数及寄主详见表1。

表1 福建省晚疫病菌株采集Tab.1 Number of P.infestans isolates collected from 3 fields in Fujian province

2.2 SSR位点多态性分析

在95个菌株中，8个SSR引物(基因座)总共检测出21个等位基因，平均每个基因座检测出2.63个等位基因。每个基因座可检测到至少2个等位基因。Pi02和Pi26基因座均检测出4个等位基因。群体内每个基因座的等位基因频率见表2。列表卡方检验表明在8个基因座中，有5个基因座的等位基因频率差异极显著(P＜0.001)。

2.3 基因型结构分析

95个菌株中共检测出26种基因型，分别编号为F1-F26(图1)，其中13种基因型只出现1次，4种基因型出现过2次。除了F7、F13和F16在两个地区(漳州和福州)同时发现外，其它的基因型都只在一个地区出现。在长乐市的致病疫霉中，有6种SSR基因型，其中F3为主要基因型，占长乐群体的70.8%。在漳州市的菌株中共鉴定出11个基因型，其中的F13的比例为32.1%。在福州市的菌株中，鉴定出12种基因型，其中F-24基因型占18.6%。F3、F13、F24分别为长乐、漳州和福州的最高频率基因型，其基因型组成结构至少差两个等位基因(表3)。

表2 致病疫霉8个基因座等位基因频率Tab.2 Allelic frequencies of eight microsatellite loci in the three P.infestans populations sampled from Fujian province

图1 马铃薯晚疫病菌SSR基因型的地理分布和频率Fig.1 Frequency and geographicaldistribution of P.infestans genotypes in Fujian province

表3 主要的SSR基因型组成Tab.3 Allelic composition of the most common P.infestans isolates in Fujian province

三个群体的纯合度的观测值均小于期望值，而杂合度的观测值均大于期望值(表4)，漳州和福州的遗传差异最小，遗传距离为0.10，而长乐与和福州和漳州的差异较大，遗传距离分别为0.53和0.31(表5)。三地区的致病疫霉菌群体平均群体遗传分化度 FST 为 0.22，基因流 0.87。

表4 福建3个致病疫霉群体的遗传变异度Fig.4 Genetic variation on the three populations of P.infestans from Fujian Province

表5 福建3个地区致病疫霉菌群体间的遗传距离及相似度Fig.5 Pairwise comparisons of genetic distance and genetic identity among three populations of P.infestans from Fujian

3 讨论

了解植物病原物群体遗传结构和进化规律对经济、有效和持久的病害控制十分重要。RAPD、RFLP，AFLP，SSR在进化过程不受或很少受自然选择的影响，通过对这些基因型的群体遗传分析，除了可以了解群体结构的变化及遗传多样性外，还可以了解致病疫霉的起源中心、传播途径或遗传迁移等［14，28-30］。SSR为共显性标记，而且具有多态性频率高，重复性好等优点。国内外学者主要采用 Lees等［21］和Knapova等［22］开发的SSR引物来分析研究马铃薯晚疫病菌的遗传遗传结构。本研究选用文献［21-22］报道的8对SSR引物测定2010年福建省福州、长乐和漳州三个点的致病疫霉的基因型组成和分布。赵志坚等对来自云南省的235个晚疫病菌菌株的多样性，共检测到8个等位基因，18个不同的 SSR基因型［20］。姚国胜等测定了中国部分地区66个马铃薯晚疫病菌菌株SSR基因型，共产生了7种SSR基因型［20］。Han等分析了甘肃2007年的85个马铃薯致病疫霉菌株，检测到26个基因型［15］。本研究在95个菌株中共检测出21个等位基因，26种基因型，而且一半的基因型只出现一次，在长乐样本中检测到6种SSR基因型，在漳州市和福州市的样本中，分别检测出11和12个基因型，说明福建致病疫霉群体遗传的遗传多样性高。福建是马铃薯种署输入省，除了农户自留种，每年都从北方和周边主产区调入大量的种薯。在调入种薯的同时，一些新的致病疫霉基因型也跟着被带进福建，这也许可以解释为什么福建马铃薯种植面积较小，但致病疫霉群体的遗传多样性相对较高。

三个群体存在较大的等位基因频率的差异。在8个基因座中，有5个基因座存在极显著的群体间等位基因频率的差异(表2)，同时群体间的Nei氏遗传相似度系数最低在0.59，最高为0.91(表5)，群体遗传分化系数则平均高达0.22。如果我们假设来自福建三个地区的亚群体间处于基因流和遗传漂变平衡阶段，则根据岛屿模式(island model)，我们可以算出群体间单一世代的平均有效基因流量(Nm)小于1，也就是说，在本研究采集的三个地区，平均每一繁殖时代只有少于一个的繁殖体从一个地区流向另一个地区，并成功地在当地定植和繁衍。在基因型方面，三个群体也存在较大的反差，相同的基因型(F7、F13和F16除外)极少在2个或2个以上地区发现，而且不同地区有各自不同的优势基因型。在长乐群体中，优势基因型为F3，占该群体的七成以上，而在漳州的优势基因型分别为F13，占该群体的三层以上，而福州的最高基因型F24的频率不到二成(图2)，而且三地区优势基因型的结构至少差两个等位基因(表3)。所以，它们由同一个基因型突变而成的可能性较低。进化理论认为地区间隔是导致群体间遗传分化的重要原因，当地区间隔阻碍亚群体间的基因流，位于不同地理区域的亚群体因持续的遗传漂变使中性变异的频率差距不断加剧，导致非适应性的群体遗传分化。致病疫霉的孢子囊可以远距离传播［30］，而长乐、福州和漳州之间的没有高山或大海等自然屏障，两两直线距离也不超过300公里，孢子囊很容易直接或通过达石(Step-stone)方式从一个地区传到另一个地区。因此，我们认为福建三个致病疫霉菌的群体遗传结构差异不是由于地理间隔造成的，而是由于不同地区使用不同起源的种薯。长乐市所种植的种薯来自于内蒙古，漳州的种薯来自于农户的自留种，而福州种薯是来自全国等地提供的进行冬作马铃薯区试验的不同品种。F13在漳州和福州同时出现却占有相当高的比例也可能是因为种薯带菌造成的，虽然漳州用的是自留种，其原始来源可能是参与福州冬作马铃薯区试验的地区之一。

三个群体纯和度的观测值均小于期望值，而杂合度的观测值均大于期望值(表4)，表明在福建有性繁殖在马铃薯晚疫病的流行和致病疫霉的进化中起的作用还不大，主要以无性繁殖为主，这和其它国家尤其是北欧的研究结果相差较大［9］。在北欧地区的瑞典晚致病疫霉菌在夏天形成卵孢子，形成大量新的基因型。

目前我国致病疫霉群体遗传研究多局限于对遗传多样性的简单描述，对遗传多样性形成的遗传机制较少探讨，这为系统分析和探讨该病原物的进化机理和可持续性马铃薯晚疫病控制带来一定困难。本研究利用分子生物学和群体遗传学理论，初步分析了我国福建致病疫霉菌的群体遗传多样性和其形成的可能机制。但本研究样本量较小，样本的空间来源比较窄，下一步将对来之我国不同生态区的致病疫霉群体进行更广泛全面的评估和分析，在全国范围内探讨该病原物的群体遗传结构和进化机制，为制定长效和生态友好型的晚疫病防治措施提供科学依据。

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