生物组织光声粘弹显微成像＊

陈丛桂，赵 岳，杨思华

(华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室，广东广州 510631)

0 引言

粘弹性是一个非常重要的物理特征参数，在描述物质在热力学和动力学的变化过程中都有重要的意义。在医学上，组织粘弹性的变化往往与病理密切相关［1］。传统的弹性成像方法仅用弹性这一参数来表征生物组织的力学特性，然而，绝大多数生物组织在力学特性上所表现出的复杂性并不是弹性模量这一项参数就可以完全表述的，在对它们粘弹性表征和流变学行为的描述中，粘滞性往往和弹性一样重要，尤其是对于软固体等生物组织，弹性不足以描述其完备的内在特性，如软骨、骨头、肌腱和肌肉等，都需要用粘滞性和弹性两者共同描述来表征特性的变化和医学的检测［2］。因此，能够检测组织粘弹性特征的检测技术在医学应用和临床研究上具有重要的意义。

光声成像融合了纯光学成像的高对比度和纯声学成像的高分辨率的优点［3-7］，在过去的十年中，光声成像在血氧饱和度的监测，脑功能成像［8］和易损斑块的检测［9］等很多生物医学应用领域中已经取得了很大的进展［10-13］。目前，常规光声显像依靠的是组织光吸收对比度，反映的是组织的光吸收系数，技术上主要是靠测量脉冲或强度调制的激光所激发出光声信号的幅值来进行组织内部光吸收分布的反演，并没有考虑到光声信号产生和传播过程中的相位信息。实际上，如果以一定频率的激光作用于组织，根据光声效应，组织就会形成热膨胀振动，从而产生与激发光频率一致的受迫超声波(即光声信号)，但由于组织粘弹性产生的阻尼效应，调制激光(相当于应力)和超声波(相当于应变)之间会产生一定的相位延时［14］。而不同粘弹性质的组织或病理在相同的激发条件下将会产生不同的相位延时。因此，利用测量的相位延时大小作为成像对比度，所重建的图像则可反映探测点粘弹性质的强弱;比较组织不同探测点的相位延迟，结合一定的图像信息处理方法，就能重建出反映组织内部粘弹特性分布的粘弹图像。为了得到更高的分辨率，可以把激光聚焦为点，用点光源来激发组织，产生声信号，得到组织的光声粘弹显微图像。

课题组在前期研究中基于热粘弹性理论结合光声效应波动方程，推导出了软固体相位延迟和粘弹性之间的关系。本文在此基础之上，构建出了高对比度高分辨率的光声粘弹显微系统，并用模拟样品验证了该显微成像系统的可行性。

1 理论背景

一个强度调制的连续激光照射在吸收各向同性的粘弹组织上，入射光强为［14］:

其中，I0是衍射光强，ω是调制频率。组织中的吸收体吸收光由于无辐射跃迁导致温度以如下正弦形式发生变化:

其中，T0是初始温度，根据热弹性机制引起组织的热膨胀和收缩产生光声信号［15］。由于光强度的周期性变化，光声波被周期性的激发并且其主频率等于调制频率，在上述过程中，局部的循环加热引起热应力，由于压力波形式的应力产生应变。因为生物组织粘弹性的阻尼效应，应变也周期性的交替变化，但是会有一个位相的延迟。考虑到光声信号的产生过程，我们选择流变学的

Kelvin-Voigt模型来表示具有粘弹特性的生物组织［16-17］，得到应变响应如下所示［18］:

其中，εA是动态复应变幅值，E是杨氏模量，ω是调制频率，η是粘度系数。由公式(3)，我们可以知道相位延迟δ和粘弹比η/E的关系:

2 实验系统与方法

图1 光声粘弹显微成像系统装置的原理图Fig.1 Scheme of experimental setup for photoacoustic and viscoelastic microscopy imaging system

实验原理图如图1所示，采用波长为808 nm的连续光半导体激光器作为激发光源，主频为50 KHz，电光调制器的调制深度为90%，函数发生器产生的调制信号(50 KHz)经放大器放大后用来提供调制器的调制电压，通过调制器的连续激光被调制为强度变化，由4×显微物镜(NA=0.1)聚焦在生物样品上，样品制成0.3 mm厚的片，激光通过聚光物镜在样品表面的光斑大小约0.1 mm，在样品表面上的激光功率密度被限制在200 mW/cm2以内，样品固定在二维电机移动平台上，超声换能器(主频:50 KHz)固定在水槽底部，经样品后产生的光声信号由超声换能器接收，经前置放大器放大后传至锁相放大器(SR830，美国斯坦福公司)，锁相放大器作为相敏检波器使用，调制信号的另一支作为参考信号输入到锁相放大器中，光声信号和参考信号在锁相放大器中进行相位比较解得两路信号的相位延时。在数据采集过程中，样品被放置在水槽中，并用蒸馏水进行声耦合。由计算机控制电机的二维扫描并分析光声信号的相位延迟，得到样品的二维光声粘弹显微图像。

3 结果

3.1 模拟样品光声粘弹成像

理论上，光声信号和参考信号之间的相位差随着样品浓度的增加而减小。为了验证系统光声信号的相位延迟与组织粘弹性的关系，分别用浓度为1.2%、2.4%和3.6%的琼脂样品模拟具有不同粘弹性能的组织进行光声粘弹显微成像，每个样品测得的相位延迟平均16次。实验结果如图2(a)所示，正如理论预期的，光声信号和参考信号之间的相位差随着样品硬度的增加而减小。此外，为了验证样品的吸收系数对光声信号相位延迟的影响，在同一浓度(2.4%)的琼脂样品中分别加入2%、4%和6%的黑墨水模拟具有不同吸收系数的组织。理论上，样品的吸收系数只影响光声信号的强度，而不影响光声信号和参考信号之间的相位差。正如图2(b)结果所示，浓度相同、吸收系数不同的样品测得的光声信号与参考信号之间的相位延迟几乎相同，而光声信号的强度随着吸收系数的增大而增大，说明组织的吸收系数可以影响光声信号的强度，但对光声信号的相位延迟影响不大。

图2 (a)不同浓度琼脂样品的光声信号的相位延迟(b)同一浓度不同吸收系数的琼脂样品的光声信号的强度和相位延迟Fig.2 (a)The phase delay obtained by PA measurement from agars with different concentrations.(b)The phase delay and PA intensity of the agar phantoms with same concentrations but different proportions of ink

3.2 系统分辨率测试

为了测试系统的分辨率，实验用直径约为60μm左右的头发丝埋于琼脂中进行光声粘弹显微成像，样品如图3(a)所示，其中红虚线框标注的区域为成像区域，对样品进行逐点扫描，重建显微图像如图3(b)所示，其中伪彩条表示组织的粘弹比，由图可知，头发丝的粘弹比明显小于周围琼脂。图3(c)为显微图像3(b)中虚线位置处的重建剖面图，由实验结果，头发丝半峰宽为57.9μm，说明该系统的成像分辨率至少能达到50μm左右。

图3 (a)琼脂中的头发丝样品;(b)样品(a)中红虚线框内区域的光声粘弹显微成像;(c)粘弹显微图像(b)中虚线处的光声信号相位延迟Fig.3 (a)Hair samples in agar;(b)Microscopic images of sample(a)within the red dotted area by photoacoustic viscoelasticity imaging;(c)Phase delay of photoacoustic signal at the dotted line in the microscopic images(b)

3.3 离体组织光声粘弹显微成像

为了验证光声粘弹显微系统的成像能力，将一片动物肌肉、一片动物脂肪和一块动物骨组织等具有不同粘弹性的生物组织置于同一平面内并用琼脂固定，如图4(a)所示。对样品进行逐点扫描，重建粘弹特性分布图像如4(b)所示，其中伪彩条表示组织的粘弹比。由图，脂肪相比于肌肉和骨组织具有更高的粘弹比，并且从光声粘弹显微图像中可以清晰地看到不同组织之间的分界，图4(a)与图4(b)也符合的很好。结果表明，光声粘弹显微成像有较好的对比度和分辨率，可以很好的重建出生物组织粘弹特性分布的显微图像。

4 讨论和结论

图4 (a)由肌肉、脂肪和骨组织构成的样品;(b)样品的光声粘弹显微图像Fig.4 (a)Sample consists of muscle，fat and bone tissue;(b)Microscopic images of sample(a)by photoacoustic viscoelasticity imaging

该成像系统的精度主要受限于锁相放大器的时间常数和信噪比，一个较大的时间常数会提高系统性能，但是会降低扫描速度，我们选择30 ms进行实验，这也是引起图4中像素值分布不均匀的主要原因。此外，我们也考虑了在不同组织中声速不同给相位测量带来的误差影响，对于厚度不足0.5 mm的样品，经过计算和实验验证由声速差异引起的相位差小于0.1 deg，因此，在样品不厚的情况下，这种影响可以忽略不计。超声换能器固定于水槽底部，使得系统扫描时光声信号由换能器单点接收，克服了换能器表面灵敏度不均匀的缺陷，大幅提高了系统的信噪比。若进一步选用高倍聚焦物镜把入射光斑聚得更小将大大提高系统的成像分辨率，再用更高灵敏度的聚焦换能器来聚焦接收光声信号，并实现反向接收模式，做成光声共聚焦反向接收模式的成像系统，这种系统具有更高的信噪比和分辨率，有望实现组织结晶水平的高分辨率成像。

本文提出了一个用光声粘弹显微成像表征生物组织粘弹特性的新方法，搭建了一套基于电动平台扫描的对向接收模式光声粘弹显微系统，用于毫米至厘米尺度范围的生物组织成像。实验结果表明该成像系统能够高对比度和高分辨率的重建生物组织的光声粘弹显微图像。这套系统最有潜力应用于动脉粥样硬化斑块和早期皮肤肿瘤的诊断检测，在生物医学研究和临床研究中都有很大的应用前景。

［1］FERRY J D.Viscoelastic properties of polymers［M］.New York:Wiley，1980.672.

［2］KOVACH I S.A molecular theory of cartilage viscoelasticity［J］.Biophys Chem，1996，59(1-2):61-73.

［3］YANG D W，XING D，GU H M，et al.Fast multielement phase-controlled photoacoustic imaging based on limited-field-filtered back-projection algorithm［J］.Appl Phys Lett，2005，87(19):194101.

［4］WANG Y，XING D，ZENG Y G，et al.Photoacoustic imaging with deconvolution algorithm ［J］.Phys Med Biol，2004，49(14):3117.

［5］LOU C，YANG S，JI Z，et al.Ultrashort microwave-induced thermoacoustic imaging:a breakthrough in excitation efficiency and spatial resolution ［J］. Phys Rev Lett，2012，109(21):218101.

［6］JETZFELLNER T，NTZIACHRISTOS V.Performance of blind deconvolution in optoacoustic tomography［J］.J Innov Opt Health Sci，2011，4(4):385-393.

［7］EIKJE N S.Potential of in vivo latent-time estimation by laser and optical techniques in clinical and experimental dermatology［J］.J Innov Opt Health Sci，2011，4(4):421-428.

［8］YANG S H，XING D，LAO Y Q，et al.Noninvasive monitoring of traumatic brain injury and posttraumatic rehabilitation with laser-induced photoacoustic imaging［J］.Appl Phys Lett，2007，90(24):243902.

［9］WANG B，YANTSEN E，LARSON T，et al.Plasmonic intravascular photoacoustic imaging for detection of macrophages in atherosclerotic plaques ［J］.Nano Lett，2009，9(6):2212-2217.

［10］YANG S H，XING D，ZHOU Q，et al.Functional imaging of cerebrovascular activities in small animals using high-resolution photoacoustic tomography［J］.Med Phys，2007，34(8):3294-3301.

［11］ZENG Y G，XING D，WANG Y，et al.Photoacoustic and ultrasonic coimage with a linear transducer array［J］.Opt Lett，2004，29(15):1760-1762.

［12］LAO Y Q，XING D，YANG S H，et al.Noninvasive photoacoustic imaging of the developing vasculature during early tumor growth［J］. Phys MedBiol，2008，53(15):4203-4212.

［13］YIN B，XING D，WANG Y，et al.Fast photoacoustic imaging system based on 320-element linear transducer array［J］.Phys Med Biol，2004，49(7):1339-1346.

［14］GAO G D，YANG S H，XING D.Viscoelasticity imaging of biological tissues with phase-resolved photoacoustic measurement［J］.Opt Lett，2011，36(17):3341-3343.

［15］张义同.热粘弹性理论［M］.天津:天津大学出版社，2002:116.ZHANG Yitong.Thermoviscoelasticity theory［M］.Tianjing:Tianjin University Press，2002:116.

［16］克里斯坦森R M.粘弹性力学引论［M］.北京:科学出版社，1990:392.CHRISTENSEN R M.Introduction viscoelasticity［M］.Beijing:Science Press，1990:392.

［17］徐芝纶.弹性力学［M］.北京:高等教育出版，2006:308.XU Zhilun.Elasticity［M］.Beijing:Higher Education Press，2006:308.

［18］ZHAO Y，YANG S H.Photoacoustic viscoelasticity imaging of biological tissues with intensity modulated continuous-wave laser［J］. InnovativeOpticalHealth Sciences， 2013， 6(4):1350033.