孤儿核受体Nr6a1的生物学功能与表达调控机制

刘晓雯，刘华伟，王伟龙，李 丹

(湖南大学生物学院，湖南 长沙410082)

1994年，Fang Chen和Austin J Cooney等人[1]从小鼠中克隆出一个核受体亚家族稀有成员-孤儿核受体亚家族6成员1(nuclear receptor subfamily 6 group member1，Nr6a1)，也称为生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF)，或维甲酸相关受体睾丸相关受体(retinoic acid receptor-related testis-associated receptor，RTR)，后来又陆续从人、斑马鱼以及非洲爪蟾等物种中克隆出其cDNA序列[2]。人Nr6a1定位于9号染色体，小鼠Nr6a1定位于2号染色体。在不同物种间Nr6a1的同源性很高，因而在功能上也具高度保守性，其配体未知，属于孤儿核受体。目前已知Nr6a1有三种转录本，转录本1大小为2.1 kb，其仅在睾丸中表达，体细胞中表达极低甚至没有；转录本2大小为3.1 kb，在小鼠附睾中受雄激素负调控；转录本3大小为7.4 kb，其在睾丸组织和体细胞中均有表达，在小鼠附睾中也受到雄激素负调控，且在小鼠胚胎癌干细胞P19中受孕激素和雌激素正调控。其中转录本1和3拥有同样的阅读框，区别仅在于3′非编码区和5′非编码区域(untranslated region, UTR)序列：7.4 kb转录本的3′UTR有4 451个核苷酸；2.1 kb转录本的3′UTR仅有202个核苷酸。在睾丸发育阶段，7.4 kb转录本比2.1 kb转录本表达更早。三个转录子编码的蛋白大小一致，均为55 kD[3,4]。

Nr6a1的结构与其它孤核受体结构基本一致，如图1，都包含N端区域(功能未知)、铰链区(基因结合区)、配体结合区域等[5-7]。大多数孤核受体的配体结合域末端都存在具有转录功能激活域2(auxiliary factor, AF-2)的结构，用于核受体的激活，并且此区域以配体依赖的方式募集共激活子而发挥功能[8]。而Nr6a1第12螺旋处孤核受体保守的氨基酸残基被赖氨酸所代替，因此不具有AF-2功能，它是以同源二聚体的形式发挥功能[4]。研究表明，Nr6a1能够特异性与雌激素重复的半位点(5′-TCAAGGTCA-3′)直接结合，半位点之间是零碱基对或是单个半位点的延伸，这个半位点称为DR0元件[1,9]。Nr6a1与靶基因启动子上的DR0位点结合后发挥转录抑制的作用，并且它还可以抑制其它核受体调节的转录激活作用[6]。

图1 孤儿核受体Nr6a1和其他核受体蛋白结构功能域示意图(根据文献[48]改编)Fig.1 Orphan nuclear receptor Nr6a1 and other nuclear receptor protein structure/functional domain schematicA/B：一个可变的N末端并且功能未知；C：DBD包含两个锌指结构，可以折叠成一个单独的结构域，它们与核心序列5-TCAAGGTCA-3作为单体结合；D：一个可变的铰链域；E：LBD是一个关键的调控域，具有多重相互作用的表面，Nr6a1的LBD末端不具有AF-2；F：一个可变的C末端A/B：A variable N-terminal region and its function is unknown;C:DNA bind domain contains two zinc-binding modules that fold to form a single structural domain that they binding with the core sequence 5-TCAAGGTCA-3 as monomers;D:A variable hinge region;E:Ligand binding domain is a key regulatory domain with multiple interaction surfaces,Nr6a1 does not have a conserved AF2 domain at the C terminal end of the LBD;F:A variable C-terminal region

1 Nr6a1的组织表达谱特征

1.1 在正常组织中的表达

Nr6a1在发育中的胎盘、神经系统以及成年人类和动物睾丸、卵巢中高表达。在成年动物的前列腺、肝、脾、小肠、直肠、肺以及脑等器官中低表达。另外，Nr6a1在成年小鼠附睾中也能检测到[1,2,10]。

在雄性生殖细胞中，研究发现Nr6a1在小鼠睾丸发育的第8天开始表达，主要定位于B型精原细胞，表明Nr6a1参与了早期精子发生的过程。Nr6a1在早期精母细胞和支持细胞中不表达，却在粗线期精母细胞和圆形精子细胞的异染色质区域中表达，提示Nr6a1在精子发生的特定阶段发挥调节作用[11]。在雌性中，Nr6a1在卵母细胞中有表达，在原始卵泡中表达缺失[12]，提示其在卵母细胞成熟中也发挥一定的功能。

1.2 在肿瘤组织中的表达

已有研究显示，Nr6a1在精原细胞瘤、无性细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎性癌、未成熟畸胎瘤中均有表达。在恶性程度较高的卵黄囊瘤或胚胎性癌中，Nr6a1呈中等或强阳性表达；在恶性程度相对低一些的精原细胞瘤、无性细胞瘤中，Nr6a1呈弱阳性，结果表明Nr6a1的表达水平可能与肿瘤的恶性程度相关[13]。研究表明，Nr6a1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞以及胚胎癌干细胞P19和NTera-2细胞中均有表达[14]，最近有报道，与正常乳腺组织相比，NR6A1在雌激素受体阳性(estrogen receptor positive, ER+)乳腺癌和雌激素受体阴性(estrogen receptor negative, ER-)乳腺癌中表达量较低，然而在三阴性(triple negative, TN) 乳腺癌组织中表达量较高[15,16]。此外，相比于正常前列腺，NR6A1在前列腺癌中高表达[17]。

2 Nr6a1的生物学功能

迄今为止，对Nr6a1基因功能的研究主要集中在分化、发育、代谢和生殖等领域。

2.1 Nr6a1参与细胞的分化与发育

研究表明在卵母细胞中Nr6a1的突变导致女性生育能力下降。在胚发育阶段Nr6a1表达对正常的胚胎形成是至关重要的，当Nr6a1丢失会导致胚胎发育10.5天时期的胚胎死亡并造成多重缺陷，包括胎盘和心血管缺陷、后截断以及破坏正常躯体形成和神经管的形成[18]。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)的自我更新是通过一些重要转录因子维持的，如Oct4、Sox和Nanog，这些转录因子维持了ESC的多能性。在ESC分化时，这些多能性调节因子首先受到抑制[19]。例如，Oct4是ESC未分化状态的标志分子，Nr6a1能够特异性募集甲基化的CpG结合域和甲基转移酶到Oct4启动子上导致Oct4的表达抑制，进而阻止ESC分化时的多能性表型[20,21]，由此调控整个胚胎发育的进程。研究表明，在人胚胎癌干细胞中，Nr6a1均可通过直接与Oct4启动子上DR0元件结合抑制其表达，从而促进分化过程[7]。这提示我们Nr6a1对ESC的自我更新和发育进程发挥重要作用。此外，在神经干细胞中Nr6a1也能够直接靶向并抑制Oct4的表达从而促进神经干细胞的分化，调节神经系统的发育[22]。

研究显示miR-302a在人ESC中高表达，Oct4和Sox与miR-302a启动子区直接结合，转录激活miR-302a的表达，并且miR-302a对ESC的增殖发挥重要的作用[23]。Hongran Wang等人[24]发现miR-302a启动子上有DR0元件，随后通过染色质免疫共沉淀实验和凝胶电泳迁移实验证明在ESC中Nr6a1能够与miR-302a结合并抑制miR-302a的表达，同时miR-302a又能够直接靶向降解CyclinD1。作者因此提出Nr6a1间接促进CyclinD1表达，进而促进ESC的增殖。

表皮生长因子1(epidermal growth factor-like cripto1，CR-1)可以调节细胞的分化，同时也是神经形成的负调节因子。在小鼠的成体组织中CR-1蛋白表达水平低，在胚胎早期发育阶段广泛表达，并发挥重要的调控功能，比如调节胚胎前后轴的形成和左右躯体的不对称性以及促进心肌细胞的分化[25]。最近研究证明在NTera-2细胞中，Nr6a1与核受体肝脏受体类似物1(liver receptor homolog, LRH-1)竞争性的结合到CR-1启动子DR0元件，Nr6a1发挥抑制CR-1表达的功能[14,26]，进一步证明Nr6a1在胚胎分化与发育发挥重要作用。

2.2 Nr6a1参与细胞代谢

线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶(mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenas，mGPDH)是甘油磷酸盐穿梭机制的必要组成，将细胞质中减少的物质等量转移到线粒体内。在mGPDH作用下，细胞质内甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸盐，从而使细胞质内的NADH氧化[27]。研究表明mGPDH促进有氧代谢，在精子获能过程中发挥作用；阻断mGPDH的表达则导致男性生育能力下降。cAMP应答元件调节因子τ(cAMP-response element modulator τ，CREMτ)是一种特异性睾丸转录激活因子，其也能够与mGPDH启动子上的DR0元件结合，激活mGPDH表达。在精子获能过程中，Nr6a1作为转录抑制因子与CREMτ竞争性的结合mGPDH启动子上的DR0元件调节mGPDH的表达[28,29]。由此可以知道在睾丸组织中Nr6a1通过与CREMτ相互作用共同调节mGPDH蛋白的表达从而影响精子获能进而影响雄性生殖力。

2015年WANG Y F等人[30]通过染色质免疫共沉淀实验发现Nr6a1直接与分泌性焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein, SPP1)启动子上结合，并证明Nr6a1通过CRE位点(cAMP response element，CRE)调节SPP1启动子活性，从而抑制SPP1蛋白在血管平滑肌细胞中的表达,进而调控血管平滑肌细胞动脉粥样硬化和血管再狭窄。

过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)，是类固醇类受体亚家族的一员[31]，包含三种亚基：PPARα、PPARδ和PPARγ[32]。其中，PPARδ参与骨的形成、脂质代谢以及表皮成熟。PPARδ缺失的小鼠会导致小鼠胚盘缺陷，妊娠中期死亡等[33]。现已证明在睾丸组织内，PPARδ是Nr6a1的靶基因，Nr6a1会抑制PPARδ的表达[34]，提示Nr6a1可能参与了调节PPARδ信号通路功能的一部分。

以上研究显示，Nr6a1直接靶向mGPDH、SPP1和PPARδ等细胞代谢小分子，从而间接影响细胞的有氧代谢和脂质代谢，表明Nr6a1可能通过影响睾丸细胞代谢进而调控其发育进程。

2.3 Nr6a1参与配子发生

精蛋白是精子形成的重要标志之一。精蛋白是由高度保守的基因家族编码的,两种精蛋白Prm1和Prm2在精子形成和雄性配子的终端分化中发挥重要作用。Till P Schmitz等人[35]证明Nr6a1与Prm1和Prm2启动子上的DR0元件结合共同调节精蛋白的表达，从而调控精子的发生。在雌性生殖发育中，Nr6a1还调节骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteinv15, BMP15)和生长分化因子(growth differentiation factors 9, GDF-9)的表达而直接调控卵母细胞与体细胞之间的旁分泌通讯，进而影响雌性生育能力[36]。动物实验显示，在生长21天和56天小鼠睾丸内处于减数分裂前期精子发生的细胞中检测到Nr6a1蛋白高表达，在卵巢中初级卵母细胞到排卵期卵母细胞均能检测到Nr6a1蛋白质表达，以及未受精的卵母细胞中也能检测到Nr6a1蛋白质的表达[37]。小鼠性腺中Nr6a1的存在表明Nr6a1在精子发生以及卵母细胞成熟中扮演一个重要角色。

3 Nr6a1的表达调控

Nr6a1作为转录抑制因子调节基因的表达，其自身的表达也受到其他因子的调节。目前研究发现微小RNA(microRNAs)、激素以及全反式视黄酸(all-trans retinoic acid, RA)等信号分子参与了对Nr6a1的调控。

3.1 MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一段长约有22个寡核苷酸的小RNA，能够调节细胞的各种生物学过程，包括有机体发育、增殖以及凋亡等。2008年，Peili Gu等人[38]通过微阵列筛选出一批能够抑制Nr6a1表达的miRNAs，比如miR-10a, miR-138, miR-199a-3p，miR-181a等，这些miRNAs在胚胎干细胞的自我更新、增殖和分化中发挥重要作用，其中miR-181a被证实能够直接靶向Nr6a13，UTR，从而抑制胚胎干细胞的增殖和分化。再如，let-7是一种高度保守的miRNAs，let-7过表达会抑制胚胎干细胞的多能性并促进小鼠和非洲爪蟾蜍胚胎的中胚层和外胚层发育[39]。近年，Gurtan等人[40]通过高通量测序和染色质免疫沉淀等方法证明let-7能够直接靶向抑制Nr6a1，并且Nr6a1在胚胎发育8.5天时表达量最高，随后在整个小鼠胚胎中与let-7呈负相关的下调，由此可以看出Nr6a1是let-7调控妊娠中期发育的一部分。

3.2 雄激素

已知睾丸和附睾大多数蛋白的表达受到雄激素的调控，并且雄激素影响圆形精子的数量，研究显示Nr6a1 2.3 kb mRNA主要在圆形精子中表达[41]，提示其可受雄激素调控。此外，在减数分裂后的睾丸生殖细胞中，Nr6a1直接靶向促性腺激素调节的睾丸RNA解旋酶(gonadotropin-regulated testicular RNA helicase，GRTH)上DR0位点实现对其表达调控，而GRTH是睾丸特异性蛋白，主要参与精子发生过程，其在生殖细胞中响应雄激素的刺激[42]。同时，实验证明小鼠附睾中雄激素能够与7.4 kb Nr6a1和3.1 kb Nr6a1启动子结合从而抑制小鼠附睾中这两种Nr6a1的表达[43]。Nr6a1在小鼠附睾的区域表达模式表明,它在调节目标基因的表达中发挥重要作用，这可能是精子成熟的必要条件。

3.3 全反式视黄酸

大量研究表明Nr6a1的表达直接受到维甲酸(retinoic acid, RA)的调控，因此被称为视黄酸受体相关睾丸相关核受体。RA作用的受体都含有一个高度保守的DNA结合区，一个连接铰链区和一个配体结合区。大多数受体，以单体形式与DNA结合区结合，RA作用的受体都能特异性识别含有AGAACA和AGGTCA序列[44]。上个世纪末，研究发现胚胎瘤干细胞(PCC7-Mz1，NT-2，P19，F9)经RA处理后能够被诱导分化成神经细胞，其中，Nr6a1的表达呈现明显上升趋势，并参与了促进神经和后脑发育进程[45,46]。RA还能够诱导胚胎干细胞早期发育时期Nr6a1的表达，此外，RA还能够促进精子发生[47]，因此RA对精子的发生与调控是否通过调节Nr6a1来实现尚是一个有待深入探讨的重要生物学问题。

4 展望和结语

自Nr6a1发现以来，在其研究领域内取得了一系列重要进展。如图2所示，鉴定了一批Nr6a1的靶基因，包括PPARβ、Oct4、Nanog、CR-1和miRNA302a等，其中Nr6a1对胚胎干细胞的分化、胚胎发育和生殖细胞形成等方面的研究较为深入。特别是研究发现Nr6a1在精子发生以及精子获能方面发挥重要作用，提示Nr6a1很有可能是治疗雄性不育的候选靶分子。 本课题组发现在小鼠精原细胞GC-1spg中，Nr6a1 受miR-181b-5p的靶向抑制参与了对GC-1spg细胞增殖与迁移的负调控[49]。另有一些研究探讨了Nr6a1在肿瘤发生发展中的作用，例如发现Nr6a1在胚胎癌干细胞中的高表达以及在肿瘤抑制中扮演一个十分重要的角色。最近本课题组研究发现Nr6a1能够通过DR0位点抑制多个代谢酶基因的表达来调节胚胎癌干细胞的代谢，从而影响癌细胞的增殖与迁移(研究结果待发表)提示Nr6a1有可能作为肿瘤治疗的候选靶点。但目前对Nr6a1互作蛋白的确定、新的靶基因的筛选以及其在肿瘤等疾病发生发展中的分子机制的了解还不是很透彻。因此，对Nr6a1在更广泛的生物学过程中的功能探索方兴未艾。

图2 孤儿核受体Nr6a1对细胞分化、发育、代谢、生殖的影响Fig.2 The effects of Nr6a1 on cell development, differentiation, metabolism and reproduction