胆红素的光学检测方法研究进展

付 笛，张子建，徐亭晚，邓小峰，陈 丹，刑 扬，姚兴旺，李雅湘，苗雄鹰，李清龙，文 宇*，熊 力*

(1.中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410012； 2.中南大学湘雅二医院，湖南 长沙 410011；3.中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410012； 4.珠海市人民医院，广东 珠海 519000)

血液中衰老的红细胞经由单核巨噬细胞系统破坏，释放出血红蛋白，血红蛋白分解产生胆红素，这是胆红素产生的主要方式。正常人每天可生成250-350 mg胆红素，当血清胆红素含量超过17.1 μmol/L称为高胆红素血症。胆红素为橙黄色物质，过量胆红素可扩散进入组织造成皮肤、黏膜、巩膜黄染，这一体征称为黄疸[1]。2009年中国住院新生儿流行病学调查显示，黄疸是住院新生儿中发病率最高的疾病[2]，严重者可发展为胆红素脑病(核黄疸)，因为未结合胆红素具有亲脂性，可进入新生儿的神经细胞并造成不可逆的损伤。一项全国性调查共报告胆红素脑病348例，约占收治患儿总数的4.8%。多中心调查显示，随访的223例病例中，42.2%有严重的神经系统后遗症，2.7%在院内死亡，13.5%出院后死亡[3]。在成年人中，黄疸也是一种常见的症状与体征，可分为溶血性黄疸、肝细胞性黄疸、胆汁淤积性黄疸和先天性非溶血性黄疸。目前检测胆红素的方法有四种[4,5]：1)采血自动生化检测，可测定总胆红素、直接胆红素和间接胆红素的含量；2)微量血胆红素仪测定；3)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)；4)使用特殊仪器检测。

特殊仪器检测目前仅应用于新生儿，包括经皮胆红素测定仪检测和拍照检测。由于成年人中存在如胡萝卜素等多种干扰，在成人中的无创检查还有待研究。下面介绍几种经皮胆红素测定仪和手机拍照检测胆红素以及它们的工作原理和优缺点。

1 经皮胆红素测定仪的理论依据和测定原理

血清胆红素皮肤、黏膜和巩膜处沉积，出现黄染，临床上称为黄疸。经皮胆红素测定仪发出特定波长的光，经皮肤与皮下组织的折射，其散射光进入经皮胆红素测定仪，经仪器运算后可得到胆红素的值。胆红素的吸收波长在460 nm处，血液中胆红素的浓度越高，反射回来的460 nm的光就越少，故可通过反射值的多少来测定血清胆红素的浓度。人体内还存在一些物质如黑色素、血红蛋白以及真皮厚度会干扰测定结果，通过一些方法排除干扰物质的影响即可得到较为精确的血清胆红素的值。下面介绍三种经皮胆红素测定仪的原理和优缺点。

1.1 国产QL1200经皮黄疸仪的原理及优缺点[6]

1.1.1 工作原理

图1 QL1200经皮黄疸仪工作原理[6]Fig.1 The working principle of QL1200 percutaneous jaundice instrument

工作电源为镍氢电池，加上稳压电路，为单片机提供稳定的电压。进行测定时，仪器在内部单片机(即计算机)的控制下，经氙闪光电路改变电压值，使之符合氙闪光管的需要。氙闪光管发出强光，照射到患儿的皮肤和皮下组织，散射光返回光学系统。经过蓝、绿两种滤光片后，反射光只留下蓝(中心波长450 nm)、绿(中心波长550 nm)两种不同波长的光。再经过硅电池的作用，光信号转变为电信号，再经由单片机(计算机)处理，处理的值最后在显示屏上显示。

1.1.2 QL1200的优缺点

血红蛋白在460 nm有较强的吸收峰，对胆红素的测量造成干扰。但巧合的是，血红蛋白在550 nm处的吸收峰与460 nm处的吸收峰相同。所以QL1200通过检测到的蓝光(中心波长450 nm)和绿光(中心波长550 nm)的差值即可得到较精确的胆红素的值。但是没有排除黑色素和真皮厚度的影响。

QL1200的测量范围是0-427.5 μmol/L。经皮胆红素测定仪早在上世纪80年代即在临床上开始应用，QL1200代表了早期的应用原理。经过不断的改进，如今市场上常用的经皮胆红素测定仪有JM-103和Bilichek。它们从不同方面对传统方法进行了改进，使得胆红素的测量变得更加精确。

1.2 JM-103的工作原理及优缺点

1.2.1 JM-103工作原理

黄疸仪JM-103也是通过测量蓝光(波长为450 nm)和绿光(波长为550 nm)的光学浓度差来确定皮下组织的胆红素的含量。

测量探测器有两个光程(见图2)。工作时氙弧灯发出的光会照射到皮肤表面，经皮肤及皮下组织的反射和折射后最终回到传感器中。传感器由玻璃纤维制造。在返回到玻璃纤维的光中，从皮下组织的浅区反射的部分最终返回到玻璃纤维的内核(短光程)，从皮下组织的深区反射的部分会穿过玻璃纤维的外核(长光程)，随后这两部分会到达光电二极管。通过计算着两部分的光学浓度从即可得到胆红素的值。

图2 JM-103工作原理图[7]Fig.2 The working principle of JM-103

1.2.2 JM-103的优缺点

皮肤分为三层，表皮、真皮和皮下组织。黑色素存在于表皮；真皮中存在丰富的血管和血红蛋白；由于可见光波长的原因，皮下组织可视为无限厚[8]。JM-103通过计算皮肤深部与浅部的光学浓度差，减少了黑色素的影响，同时应用蓝绿两种波长的光，排除血红蛋白的影响，故结果与传统方法相比更为精确。

1.3 Bilichek的工作原理和优缺点

1.3.1 Bilichek的工作原理

仪器通过卤钨光源发光，经红外、紫外滤光片后得到白光。白光照射到新生儿的皮肤表面，经折射散射后返回微型光谱仪。然后对反射光的100多个波段进行光谱分析，并将反射光的强度转化为吸收度单位光密度(OD)。绘制总量、胆红素、黑色素、血红蛋白和真皮的OD曲线，然后经过专门的算法得出血清胆红素的OD值(OD 胆红素=OD总量-OD黑色素-OD血红蛋白-OD真皮)。

1.3.2 Bilichek的优点

JM-103和Bilichek是目前市场上最常用的两种经皮胆红素测定仪。有多位学者对它们进行过比较。Pratesi S等人发现[9]，Bilichek 和JM-103经皮胆红素测定仪相关性良好，但是与JM-103相比，Bilichek 在胆红素轻或中度升高时会高估胆红素的值，在胆红素重度升高时会低估胆红素的值；通过对133名早产儿的研究，Ebbesen F等人发现[10]，JM-103的测量值比Bilichek的测量值低得多，当胆红素浓度增加时，JM-103测量值增加的程度却被过低估计。在对630名新生儿进行研究后，Costantino等人发现[11]，JM-103相较于Bilichek在精确度上略有优势，但是在高胆红素水平的情况下的应用还有待进一步研究。

下面(表1)是三种经皮胆红素测定仪的性能比较：

由于实际检测中人体内影响机制不够明确，方法构建的理论假设比较理想化，还有干扰物的影响，市场上经皮胆红素监测仪虽然与血液中总胆红素TSB相关性良好，但是普遍精度不高。并且是否接受光疗、测定部位、年龄、种族、性别、身体状况(是否贫血等)都会对胆红素的测量造成影响[12]。

1.4 经皮胆红素仪的临床应用

因为肤色对QL-1200影响较大，实际监测结果较总血清胆红素(total serum bilirubin, TSB)误差显著，目前基本被淘汰，故不再过多赘述。JM-103、Bilichek以及一些其他品牌型号的经皮胆红素仪占据目前主流市场，较新的临床统计研究也多以此类胆红素仪为基础。首先，Yvonne M等人报道经皮胆红素值(transcutaneous bilirubin, TcB)与TSB具有良好的相关性[13]，P值均小于0.0001，JM-103和Bilichek的相关系数分别为0.70和0.88，其他文献也认为Bilichek比JM-103具有更好的预测效果[14,15]。国内虽然没有直接关于JM-103和Bilichek比较的文献，但是TcB和TSB相关性亦较好，甚至还要优于国外报道(相关系数最高达0.909，最低为0.795)[16]。其次，因为新生儿肝功能尚不完全，由自体肝脏产生的结合胆红素极少，故陈丽等人对TcB和间接胆红素的拟合度及TcB和TSB的拟合度分别进行了统计分析，结果表明间接胆红素与TcB的相关程度(r=0.995)比TSB的相关程度(r=0.891)更高，P均小于0.001，说明TcB更能反应间接胆红素并以此评估黄疸轻重[17]。但是，TcB的检测仍有不可忽视的局限性存在，金霞等人的研究中，在轻度高胆红素血症时，TcB与TSB的相关系数为0.909，但在中重度高胆红素血症的新生儿中，TcB与TSB的相关系数将显著下降，仅为0.639，意味着单纯TcB检测可能会延误中重度高胆红素血症患儿病情或者过度治疗[18]。

此外，还有学者通过研究利用手机拍照来测定新生儿黄疸。在2014年GREEF L D等人研发了一个新的、可以检测新生儿黄疸的软件，Bilicam[19]。

表1 三种经皮胆红素测定仪性能比较Tab.1 Performance comparison of three kinds of percutaneous bilirubin analyzer

2 拍照检测胆红素

2.1 Bilicam的工作原理

将颜色校准卡置于新生儿的胸骨处，然后用手机进行拍照，最后对图像进行处理得到相应的胆红素的值。颜色校准卡可以平衡图像颜色，因为在不同的光照条件下采集到的图像可能会有很大的区别。通过机器学习(图3)来估计胆红素水平，Bilicam所得的结果与金标准TSB所得的结果线性相关系数为0.85[20]。

胸骨处的皮肤无法排除黑色素、血红蛋白和真皮厚度的影响，而巩膜为瓷白色，不含黑色素，血管也极少。2015年，Terence S Leung等人提出了用数字摄影技术检查新生儿巩膜黄疸[21],他们在对新生儿巩膜拍照后得到相应的图像，利用matlab软件对这些图像进行了分析。然后基于测量的TSB水平和数据库中的颜色指标建立一个多变量模型，再用matlab及其统计资料和机器学习工具箱进行多元线性回归。最后可以得到估计胆红素水平的模型，此方法的线性相关系数为0.75。

2.2 拍照检测胆红素类软件的应用

Bilicam是华盛顿大学的研究者基于100名新生儿出生后2-5天的TSB和带有校准卡的胸部照片数据开发的主要用于院外黄疸检测筛查的手机APP，Bilicam一重要优势在于获取更多的新生儿数据后，可以进一步优化算法，提高检测准确性[20]。2017年，华盛顿大学James等人基于530例样本进一步更新Bilicam后，和TSB相比总相关系数已经高达0.91，白人、非裔、西班牙裔、亚裔肤色相关系数分别为0.92、0.90、0.91和0.88，两种截断值的诊断灵敏度为84.6%和100%，特异度为75.1%和76.4%，其诊断准确程度已经不亚于经皮胆红素仪测定的结果[22]。

图3 新生儿黄疸检测系统原理[18]Fig.3 Principle of neonatal jaundice detection system

3 总结和展望

综上所述，目前临床上常用的胆红素无创筛查工具为经皮胆红素测定仪，最广泛用于新生儿黄疸的筛查，其中最普及的两种经皮胆红素测定仪为JM-103和Bilichek，它们都是利用光对人体组织进行检测，处理方法有所不同，在一定范围内较为精确，在胆红素过高或较低时不太准确。由于经皮胆红素测定仪的成本太高，仅限于有条件的医院使用，为了在家庭里也能方便快捷地测量胆红素，研究人员开始着手于开发相应的手机拍照软件对胸骨或者巩膜进行胆红素的测量，经过不断的软件优化更新，拍照胆红素测定与金标准TSB的偏差正在迅速缩小。虽然目前无创的胆红素光学检测方法多应用于新生儿，但是现有的研究已经证明上述无创方法的精确度正逐步提高，且与游离胆红素有更好的拟合程度[17]，因此可以预见，经过改良更新后经皮胆红素检测仪或拍照胆红素检测软件极有希望应用于更广泛人群的胆红素初筛当中，具有巨大的前景。