肺曲霉球1例及实验研究

邵锦 余进 万喆 李若瑜 王爱平

(北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034)

曲霉在自然界无处不在，是环境中最常见的分离菌[1]。曲霉病最常见的致病曲霉有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等，烟曲霉在深部真菌感染中最多见[2]。近年来曲霉所致条件性感染发病率不断上升，已成为仅次于念珠菌感染的深部真菌病[3]。现报告1例肺真菌球术后组织病理通过免疫组化染色确诊为肺曲霉球的病例。

1 临床资料

患者男，43岁，因“咯血半月余”于2017年2月28日收入我院胸外科。患者半月前无明显诱因出现咯血，整口鲜血，约十余口，无食物残渣，无明显咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难及发热。就诊于当地医院胸片检查发现左肺上叶占位，遂再行胸部CT检查提示“左肺上叶片状高密度影”(见图1～2)。之后在我院行PET-CT检查提示左肺上叶尖段结节影，轻度放射性摄取，考虑良性结节可能性大。以“左肺上叶占位”收入院。患者发病以来，精神、睡眠、食欲可，二便正常，体重无明显变化。否认系统疾病史；否认家族史。

体格检查：一般情况良好，全身浅表淋巴结未触及肿大，心、肺、腹检查未见明显异常，全身皮肤未见异常。实验室检查：血常规、血沉、血生化、感筛4项及出凝血功能检查未见明显异常，肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶44.2 ng/mL (正常<16.3 ng/mL)升高。痰找抗酸杆菌阴性，结核分枝杆菌培养阴性，支气管分泌物真菌培养阴性，PPD试验及T-SPOT.TB试验阴性，G试验及GM试验阴性。胸部增强CT显示左肺上叶尖后段可见不规则软组织密度灶，增强扫描见边缘少许强化，其内可见新月形气体密度。肺泡灌洗液超薄细胞涂片见纤毛柱状上皮细胞、肺泡上皮细胞、小淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞，未见肿瘤细胞。因患者咯血明显给予患者行左肺上叶切除术。术后组织病理显示慢性支气管炎，支气管扩张，腔内可见真菌菌团，HE、PAS及GMS染色阳性，形态上倾向为曲霉 (见图3～6)。免疫组化显示炎细胞IgG+，IgG4散在+，Kappa+，Lambda++；肺泡上皮CK7+++；平滑肌细胞SMA+，Desmin+，HMB45-，S100-。最终诊断：肺真菌球，曲霉感染可能性大。出院后患者就诊我科，再复查G试验及GM试验阴性，因患者的病灶已经完全切除，未给予患者进行系统抗真菌药物治疗。

2 实验研究

由于患者手术切除病变组织未进行真菌培养，组织病理形态上倾向为曲霉，因此，无法准确确定病原菌。本研究对病变组织的蜡块组织进行了相关实验研究，尤其是免疫组化及 PCR，试图将真菌鉴定到属。本研究获得患者知情同意。

2.1 真菌荧光染色

选择4例非结核性分枝杆菌肉芽肿标本作为阴性对照。使用防脱玻片，对患者及阴性对照蜡块组织进行石蜡切片，厚4 μm，常规烤片、脱蜡，去离子水洗，稍晾干。滴加真菌荧光染色液 (江苏莱芙时代生物科技有限公司)覆盖组织，染色1 min，倾去染液，去离子水稍洗，晾干。中性树脂封片，平铺通风放置后在荧光显微镜下观察。本研究标本真菌荧光染色阳性，荧光显微镜下可见真菌菌团，亮蓝色有隔菌丝，呈锐角分支，背景灰蓝 (见图7)。4例非结核性分枝杆菌肉芽肿标本染色均呈阴性结果。

2.2 免疫组化染色

选择1例肺烟曲霉感染标本作为阳性对照，1例少根根霉感染及1例不规则毛霉感染标本作为阴性对照。常规石蜡切片、烤片、脱蜡，切片放入柠檬酸钠溶液中，进行水浴热修复，室温冷却后PBS洗涤；滴加3%H2O2液封闭10 min，PBS洗涤；滴加1∶1 000稀释的一抗置于4℃冰箱过夜，PBS洗涤，滴加二抗黄色增强液15 min，PBS洗涤；滴加二抗红色试剂15 min，PBS洗涤；DAB显色时，取切片置于显微镜下观察，切片背景清晰，菌丝着色好，呈棕色时结束显色，PBS洗涤，苏木素复染，封片。一抗：兔抗曲霉多克隆抗体，对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉特异，购自美国RayBiotech公司。通用型二步法检测试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。本研究标本及阳性对照均为阳性结果，显微镜下观察本研究免疫组化染色结果，可见菌丝染成棕褐色，尤以细胞壁着色明显，组织细胞核蓝染，易与阳性菌丝成分区分 (见图8)。2例阴性对照均为阴性结果。

2.3 组织PCR

按照Qiagen石蜡包埋组织DNA提取试剂盒说明书提取蜡块组织中DNA，分别使用真菌鉴定通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')、U1 (5'-GTGAAATTGTTGAAAGGGAA-3')和U2 (5'-GACTCCTTGGTCCGTGTT-3')于PCR扩增仪进行扩增[3]。PCR扩增体系及反应条件参考文献中实验方法[4]。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。但琼脂糖凝胶电泳未出现相应条带。

3 讨 论

慢性肺曲霉病 (CPA)是指由曲霉感染引起的一组感染性疾病，通常表现为长期反复的咳嗽，呼吸困难和体重减轻，偶尔发生急性症状如咯血，支气管或肺出血[5]。CPA最新指南指出慢性肺曲霉病根据临床表现分为5类：单发/单纯曲霉球、曲霉结节、慢性空洞型肺曲霉病、慢性纤维化肺曲霉病和慢性坏死性/亚急性侵袭性肺曲霉病[6]。该患者为中年男性，主要症状为咯血，胸部增强CT显示“左肺上叶尖后段不规则软组织密度灶，其内可见新月形气体密度”，手术切除病灶后组织病理证实为肺真菌球，曲霉感染可能性大，免疫组化提示病原菌为曲霉属，最终诊断为单纯肺曲霉球。曲霉病指南 (2016)关于肺曲霉球的治疗中指出，对于有症状的单纯曲霉球患者，特别是有明显咯血者，若没有禁忌症的话，应该手术切除[7]。该患者因为咯血而行左肺上叶切除术。

图1～2左肺上叶片状高密度影 (箭头处)图3病理片示支气管扩张，腔内可见真菌菌团 (箭头处)图4～6HE、PAS、GMS染色可见大量菌丝互相缠绕形成真菌菌团×400图7真菌荧光染色法可见亮蓝色有隔菌丝，呈锐角分支 (箭头处)图8免疫组化染色可见菌丝染成棕褐色×400

Fig.1-2High density shadow on the superior lobe of left lung (arrow)Fig.3Histopathological sections showed bronchiectasis, fungal ball visible in the cavity (arrow)Fig.4-6HE, PAS, GMS showed a large number of hyphae forming fungal ball×400Fig.7Fungal fluorescence staining showed bright blue septate hyphae, with sharp-angle branch (arrow)×400Fig.8Immunohistochemical staining showed brown hyphae×400

目前对于曲霉感染诊断的金标准主要依靠组织真菌培养阳性，通过形态学及分子生物学进行菌种鉴定，其中DNA测序技术可以帮助准确鉴定菌种，但是DNA测序步骤相对复杂，大部分临床实验室难以自行开展。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)是近年来新兴的菌种鉴定技术，能快速鉴定病原微生物[8]。MALDI-TOF MS在真菌领域最先用于酵母菌鉴定，之后一些研究者进行了丝状真菌的研究，包括曲霉、皮肤癣菌、毛霉等，其在种水平的鉴定效果均较好[9-12]。尤其是曲霉鉴定，其准确率可高达90%以上[13]。MALDI-TOF MS在临床真菌鉴定方面具有较大的应用前景。

以上的鉴定基于培养出的真菌，真菌培养过程较缓慢，需要几天到几周的时间。组织病理学方法可以早期快速地鉴定真菌感染。HE、PAS、GMS染色为真菌组织病理学常用的染色方法，通过显示组织中的真菌成分来确定是否存在真菌感染。真菌荧光染色法在国内是较新的染色方法，染色比较敏感。荧光染色液能够与各类真菌细胞壁几丁质结合而发出荧光，可以清楚得显示真菌菌丝、孢子及隔膜等成分。已有研究证实真菌荧光染色法在浅部真菌病标本中阳性检出率明显高于KOH湿片法[14]。无论是传统的组织病理学染色还是真菌荧光染色，它们均为非特异性的染色方法，具有一定的局限性。一些致病真菌在组织中形态相似，仅依靠形态学很难鉴定。通过组织病理学染色找到曲霉的典型形态特征较困难，有时与毛霉、镰刀菌、赛多孢霉等丝状真菌难以区分。

免疫组化是根据真菌抗原性不同来鉴定组织中真菌的一项病理技术，可以提高真菌鉴定的特异性和病原学诊断水平。使用属或种特异性抗体可以将某些真菌鉴定到属或种。目前已有针对念珠菌属、隐球菌属、曲霉属、毛霉目、孢子丝菌属、马尔尼菲篮状菌的特异性抗体用于真菌鉴定的报道[15]。有研究表明使用兔抗曲霉多克隆抗体通过免疫组织化学法识别组织中曲霉成分的敏感性高达88%，并且具有很高的特异性，与毛霉、念珠菌、暗色真菌以及其他透明丝孢霉没有交叉反应，可以准确将其与其他丝状真菌区分开来[16]。本研究使用兔抗曲霉多克隆抗体，能够特异性的识别肺组织的曲霉成分，阳性菌丝成分被染为棕褐色，清楚直观，帮助确定病原菌为曲霉属。毛霉病标本作为阴性对照其菌丝未着色，所以应用该抗体进行免疫组化可以区分曲霉与毛霉感染，可应用于临床病理怀疑曲霉感染的快速诊断。

组织PCR可以帮助鉴定蜡块组织中真菌，但敏感性不高[17]。本研究中我们尝试从蜡块组织中提取DNA，进行PCR扩增，然而琼脂糖凝胶电泳检测时无条带产生。分析原因可能与从福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取真菌DNA浓度低以及甲醛诱导的DNA-蛋白质交联抑制长片段DNA的扩增有关。

综上所述，真菌荧光染色可以帮助确定是否存在真菌感染，但不能确定真菌的种属水平，组织PCR用于鉴定石蜡包埋组织中真菌的敏感性不高，而免疫组化技术用于真菌鉴定具有较高的敏感性和特异性。因此，当病变组织缺少真菌培养结果时，免疫组化技术可以帮助快速确定菌属，有助于临床诊疗。鉴于本研究结果仅来自于一个病例，有待于今后积累更多的病例进行验证。