反转录转座子TCA4与白念珠菌耐药性的研究

苗琦 张石群 曹永兵 姜远英

(中国人民解放军第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)

随着癌症放疗、化疗、器官移植、艾滋病患者的增加，广谱抗生素、免疫抑制剂的长期广泛应用，深部真菌感染已逐渐成为一种常见病、多发病，并已成为这些免疫功能低下人群死亡的主要原因。在深部真菌感染中，念珠菌是最常见的病原菌［1］，而且由于临床可用的抗真菌药物有限，真菌耐药现象日益严重，成为临床治疗失败的主要原因。

在玉米、小麦、小鼠、人类的基因组中，反转录转座子分别占78%、68%、52%和45%，通常情况下被严格控制［2］。研究表明，反转录转座子在很大程度上是侵略性的，会导致基因的失活和基组的不稳定因组的组分，进化成启动子、增强子或者沉默子，从而调节相关基因的表达［3］。所有的真核生物中的一个普遍生物学现像，就是生物和非生物胁迫可激活反转录转座子的活性，介导物种的快速适应。例如植物在环境胁迫情况下，可激活反转录转座子，从而调节植物抗逆相关基因的表达。因此转座是植物自我保护的一种反应［4］。细菌的反转录转座子可以介导耐药性的形成，并通过反转录转座子的水平转移和克隆播散方式传播多种耐药基因，是导致细菌耐药菌株增多的重要因素。例如转座子Tn除了携带与转座有关的基因外，还携带有耐药基因的一段可移动DNA序列。Tn在同一细胞的染色体与质粒间跳跃移动，可使耐药基因大量增加，产生耐药。Tn916样接合转座子就是散播tetM基因介导的四环素、米诺环素耐药的重要载体［5］;复合型转座子 Tn5385则介导了链霉素、四环素、庆大霉素、红霉素等耐药性［6］。而酿酒酵母的反转录转座子Ty1在通常情况下也是沉默的，但在胁迫条件下可被激活并转座。这些胁迫包括:紫外照射、X-光辐射、氮饥饿、低温刺激［7］以及腺嘌呤饥饿［8］。

本研究目的在于研究高温诱导白念珠菌中反转录转座子TCA4的表达情况与其耐药性产生的关系。采用spot assay考察高温诱导菌株对药物的耐受能力，并用实时定量PCR方法检测诱导菌株中反转录转座子TCA4的表达水平与氟康唑耐药的关系。

1 材料和方法

1.1 实验菌株与药敏检测

白念珠菌(Candida albicans)ATCC-10231由第二军医大学长征医院菌种保存中心馈赠。参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的M27-A微量液基稀释法测定实验菌株对氟康唑的敏感性。

1.2 培养基

沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，调整pH至7.0，定容至1 000 mL，高压灭菌，4℃保存。YEPD培养液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，定容至1 000 mL，高压灭菌，4℃保存。

1.3 主要试剂

30%过氧化氢 (国药集团化学试剂有限公司)，咪康唑 (miconazole，MCZ，Sigma)，二甲基亚砜 (dimetuyl sulfoxide，DMSO)为国产分析纯，用前重蒸。真菌RNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)，柱式RNA clean试剂盒 (北京天恩泽基因科技有限公司)，实时定量PCR所用试剂均购自TaKaRa公司:DNaseI(RNase Free)(CodeNo.D2215)，Reverse Transcriptase XL(AMV)(CodeNo.D2620)，Ribonuclease Inhibitor(CodeNo.D2310A)，Random Primer(6mer)(CodeNo.D3801)，dNTP Mixture(CodeNo.D4030A);SYBR-GreenI Premix Ex Taq(CodeNo.DRR041);引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 仪器与装置

T-gradient PCR仪、荧光定量real-time PCR仪(Bio-Rad);Multiskan MK3型酶标检测仪 (Labsystems);MJX型智能霉菌培养箱 (宁波江南仪器厂制造);Eppendorf 5417R高速冷冻离心机 (Eppendorf);紫外分光光度计 (Unico UV-2000 Spectrophotometer)。

1.5 高温诱导子代的获取

在YEPD固体培养基中平行选取亲本菌株ATCC-10231中的三个单克隆，分别转移到1 mL新鲜的YEPD培养液中于37℃培养16 h，以后每次传代均从上代培养液中取10 μL转移到1 mL新鲜的YEPD培养液中37℃培养得到子代，共传24代得到子代ATCC-10231-37℃。

1.6 spot assay实验

首先浇铸含药的SDA平板:将配置的SDA高压灭菌 (121℃，15 min)，待培养基冷却至不烫手后加入药物，使最终溶液的浓度达到咪康唑(MCZ)2 μg/mL，H2O25 mmol/L，彻底混匀后倒入无菌的平皿上，静至冷却。将白念珠菌 ATCC-10231和ATCC-10231-37℃在YEPD培养液中分别连续2次活化16 h达到对数生长期后期，3 000×g离心5 min用1 mol/mLPBS洗2次，血细胞计数板计数，用YEPD培养基调整菌液浓度为1×107cells/mL，10倍倍比稀释得到5个密度梯度，即1×107cells/mL，1 ×106cells/mL，1 ×105cells/mL，1 ×104cells/mL，1 ×103cells/mL，取4 μL 菌液点在含药平板上，于30℃静置培养48 h，观察菌在平板上的生长情况并拍照记录实验结果。

1.7 生长曲线实验

将白念珠菌ATCC-10231和ATCC-10231-37℃以1∶100接种至1 mL YEPD培养液，于30℃，200 r/min振荡培养16 h，活化两次，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至YEPD培养液中，用上述方法再次活化16 h后，以紫外分光光度计600 nm测菌液OD值，以YEPD培养液稀释并调整菌液浓度至OD值为0.1。分别于100 mL上述菌液中加入氟康唑16 g/mL，空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5%。于30℃孵箱中，以200 r/min 振荡培养，分别于 0、2、4、6、8、20、24 和30 h，各样品分别取 100 μL 液体，以紫外分光光度计600 nm测菌液OD值，以OD值确定其菌生长浓度的变化。

1.8 实时定量PCR对反转录转座子TCA4中ORF表达水平的考察

采用真菌RNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)进行总RNA抽提，用DNA酶去除基因组DNA污染后利用紫外分光光度仪检测RNA的纯度和浓度，使其OD260/OD280值应大于1.8小于2.1，并对RNA进行定量。

RNA反转录为cDNA 按体系配制反转录混合反应液 5 ×PrimeScript Buffer(4 μL)、Enzyme MixI(1 μL)、Oligo(dT)Primer(1 μL)、Random 6 mers(1 μL)、RNA(1 μg)、RNase Free dH2O(终体积为20 μL)。混匀后按如下条件进行反转录合成37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃暂存。反应液配制在冰上操作，所用枪头及PCR管均在实验前用焦碳酸二乙酯(DEPC水)进行去RNA酶处理。

RT-PCR反应 目的基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列见表1。按照以下体系冰上配置 RT-PCR反应液:2×SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、Primer FWD(0.5 μL)、Primer RV(0.5 μL)、模板 cDNA(2 μL)、ddH2O(7 μL)。混匀后按如下条件进行RT-PCR反应:95℃ 1 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40 个循环。记录反应终止循环阈值(cyclethreshold，Ct)，用内参18SrRNA的Ct值校正目的基因Ct值，得到△Ct，比较实验组和对照组的△Ct得到△△Ct，基因表达量比值 (实验组/对照组)=2-△△Ct。

1.9 统计学处理

实时定量RT-PCR获得的是每个基因的Ct值，通过18SrRNA内参校正获得△Ct［△Ct=Ct(目的基因)-Ct(18SrRNA)］，再通过与参照菌株ATCC-10231相比获得△△Ct［△△Ct=△Ct(实验菌株)-△Ct(参照菌株)］，用Ratio值 (实验菌株与ATCC-10231菌株相比基因表达情况)表示基因表达水平，Ratio值=2-△△Ct，以Ratio值＞2代表与ATCC-10231基因表达情况相比，基因发生高表达。实时定量PCR进行3次独立重复实验，所得Ratio以(±s)表示，统计反转录转座子TCA4中ORF高表达。

2 结 果

2.1 药物敏感性实验

通过微量液基稀释法发现:亲本菌 ATCC-10231 对氟康唑的 MIC80=0.5 μg/mL，高温诱导菌株 ATCC-10231-37℃的 MIC80≤0.125 μg/mL。

2.2 spot assay实验

经过高温连续诱导的白念珠菌对氟康唑的耐受能力明显降低。与亲本菌ATCC-10231相比，长期高温刺激后的ATCC-10231-37℃对咪康唑 (2 μg/mL)和H2O2(5 mmol/L)都更加敏感，而在空白YEPD培养基上生长状况没有差别(见图1)。

2.3 YEPD培养液中生长曲线实验

结果显示16 μg/mL氟康唑24 h内对ATCC-10231-37℃的抑制作用明显高于对ATCC-10231的抑制作用。进一步证明与亲本菌ATCC-10231相比，长期高温刺激后的ATCC-10231-37℃对药物变得更加敏感 (见图2)。

2.4 TCA4 中 Orf19.2668 和 Orf19.2669 的表达水平测定

根据实时定量RT-PCR实验获得Ct值和计算获得的Ratio值:高温诱导菌株ATCC-10231-37℃中反转录转座子TCA4的开放阅读框Orf19.2668和Orf9.2669与亲本菌ATCC-10231相比均发生高表达 (见图3)。

3 讨 论

在深部真菌感染中，白念珠菌易于感染，难以防治的关键原因是其具有高适应性的特点。所有真核生物中的一个普遍生物学现象就是生物和非生物胁迫可激活反转录转座子的活性，介导物种的快速适应。据文献报道，反转录转座子TCA1［9］，TCA2［10］，TCA5［11］以及非 LTR 反转录转座子 ZORRO元件 (ZORRO2和ZORRO3)［12］都是具有转座活性的反转录转座子。从生物进化角度来说，反转录转座子可以动态改变基因组结构及功能，会使细胞积累一些变异，从而改变细胞在新生存环境中的存活能力。

图1 点板实验结果 图2 生长曲线实验结果 图3 ATCC-10231-37℃与ATCC-10231中反转录转座子TCA4中两个ORF的表达情况Fig.1 Results of spot assay.Each strain was grown from D600=0.1 until D600=0.1=1.0，4 μL of each dilution was spotted onto YEPD-agar plates supplemented with drugs.Plate were incubated for 48 h at 30℃ Fig.2 Growth curves of fluconazole(FLC)against C.albicans ATCC-10231 and ATCC-10231-37℃ Fig.3 Relative expression values of retrotransposon TCA4＇s ORFs(Orf19.2668 or Orf19.2669)in the high temperature induced strains and the wild type strsin.18SrRNA was used as the internal control.n=3，珋x ± s

本研究通过微量液基稀释法、spot assay实验以及对氟康唑的生长曲线实验均发现与亲本菌ATCC-10231相比，高温长期诱导菌株 ATCC-10231-37℃对抗真菌药物敏感性明显降低，说明高温是调控白念珠菌对环境胁迫产生适应性，介导菌株对药物敏感性改变的原因之一。在此基础上，采用实时定量RT-PCR方法检测白念珠菌敏感株ATCC-10231及其诱导菌株ATCC-10231-37℃中反转录转座子TCA4中两个具有编码蛋白功能的开放阅读框Orf19.2668和Orf19.2669的表达水平，发现ATCC-10231-37℃中TCA4的两个开放阅读框表达量相对于亲本菌的有明显升高，说明高温刺激改变了白念珠菌反转录转座子TCA4的活性，其RNA拷贝数的显著性差异证明了TCA4是依赖于温度的反转录转座子。Holton等［10］的研究表明，反转录转座子TCA2在高温诱导的条件下转座发生率明显升高，表达量升高。而与此相反，TCA1［9］却是在低温诱导的条件下转座发生率更高。由此我们推测，生存温度改变是导致TCA4转座激活，进而造成ATCC-10231-37℃较亲本菌对抗真菌药物敏感的因素之一。

因为白念珠菌耐药现象的产生是多机制共同作用的结果，包括外排泵蛋白高表达，药物作用靶酶高表达或变异，生物被膜产生等，反转录转座子转座激活也是白念珠菌耐药机制之一。本研究探讨反转录转座子对白念珠菌耐药性形成的调控作用及其机制，发现白念珠菌ATCC-10231在高温的刺激下通过改变反转录转座子TCA4的活性来调控白念珠菌对氟康唑的适应性。不仅有助于阐明白念珠菌耐药性形成新机制，也为进一步研究反转录转座子对白念珠菌其他适应性的调控作用，以及研究其在白念珠菌中更广泛的生物活性奠定工作基础。

［1］廖万清，顾菊林.深部真菌感染治疗的现状与对策［J］.中国

感染与化疗杂志，2007，9:101-103.

［2］Moore JK，Haber JE.Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand breaks［J］.Nature，1996，383(6601):644-646.

［3］Brosius J.RNAs from all categories generate retrosequences that may be exapted as novel genes or regulatory elements［J］.Gene，1999，238(1):115-134.

［4］Kimura Y，Tosa Y，Shimada S，et al.OARE-1，a Ty1-copia retrotransposon in oat activated by abiotic and biotic stresses［J］.Plant Cell Physiol，2001，42(12):1345-1354.

［5］Rice LB.Tn916 family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance determinants［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(8):1871-1877.

［6］Rice LB，Carias LL.Transfer of Tn5385，a composite，multiresistance chromosomal element fromEnterococcus faecalis［J］.J Bacteriol，1998，180(3):714-721.

［7］Stamenova R，Dimitrov M，Stoycheva T，et al.Transposition ofSaccharomyces cerevisiaeTy1 retrotransposon is activated by improper cryopreservation［J］.Cryobiology，2008，56(3):241-747.

［8］Todeschini AL，Morillon A，Springer M，et al.Severe adenine starvation activates Ty1 transcription and retrotransposition inSaccharomyces cerevisiae［J］.Mol Cell Biol，2005，25(17):7459-7472.

［9］Chen JY，Fonzi WA.A temperature-regulated，retrotransposonlike element fromCandida albicans［J］.J Bacteriol，1992，174(17):5624-5632.

［10］Holton NJ，Goodwin TJ，Butler MI，et al.An active retrotransposon inCandida albicans［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(19):4014-4024.

［11］Plant EP，Goodwin TJ，Poulter RT.Tca5，a Ty5-like retrotransposon fromCandida albicans［J］.Yeast，2000，16(16):1509-1518.

［12］Goodwin TJ，Ormandy JE，Poulter RT.L1-like non-LTR retrotransposons in the yeastCandida albicans［J］.Curr Genet，2001，39(2):83-91.