新生隐球菌GXM的纯化及其对巨噬细胞甘露糖受体表达调节的研究

李平 谭宏月 胡婵 陈丽华 皇幼明 钟彬 朱红梅 温海

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

新生隐球菌易于感染免疫功能低下人群，如HIV感染、器官移植及血液肿瘤患者等，由于其嗜中枢特性，常可导致致命性的中枢神经系统感染。隐球菌荚膜是重要的毒力因子，组成成分包括葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖(GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)和少量的甘露糖蛋白(MP)等，其中GXM占多糖成分的90%以上，既可以黏附在细胞壁上形成荚膜结构，也可以释放到培养上清中。GXM可以增强隐球菌抵抗吞噬细胞的吞噬作用，也可以诱导机体产生抑制性细胞因子IL-10、抑制机体产生炎性细胞因子 IL-2、TNF-α 和 IFN-γ等［1-2］，在隐球菌逃逸机体的抗感染免疫中发挥重要作用。我们的前期工作发现隐球菌能下调巨噬细胞MR的表达，因此本文详细介绍了如何从新生隐球菌B3501中分离和纯化GXM，并探讨了隐球菌GXM对巨噬细胞MR表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

新生隐球菌采用B3501标准株，由中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供。真菌培养基采用YNB培养基 (YNB粉末6.7 g，葡萄糖5 g，氯霉素200 mg，定容至1 L，过滤除菌)及YPD平板 (酵母抽提物10 g，蛋白胨20 g，氯霉素200 mg，琼脂15 g，定容至900 mL，高压灭菌，冷却至60℃后加入无菌的20%的葡萄糖100 mL制成平板)。C57BL/6J(H-2Kb)小鼠，雌性，6～8周龄，购自上海必凯实验动物有限公司。

1.2 主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、酵母氮基础(YNB)购自Sigma，CTAB配制成0.3%的水溶液置常温备用。酵母抽提物、蛋白胨、氯霉素、琼脂糖、苯酚、硫酸、无水乙醇、NaCl、葡萄糖、磷酸钠均为国产分析纯试剂，DEAE琼脂糖凝胶CL-6B柱购自GE公司，M-PER蛋白抽提试剂、BCA蛋白检测试剂盒、Western荧光检测试剂购自Pierce，HRP标记抗羊IgG购自Santa Cruz，羊抗鼠MMR抗体、内参抗体兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)抗体购自R＆D公司。

1.3 方法

新生隐球菌B3501培养上清的乙醇沉淀法从平板上挑取一个菌落，接种至1 L YNB培养基中，30℃摇床培养3～4 d，9 000 r/min离心收集上清，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，此时会出现奶状沉淀，摇匀后置4℃过夜。次日于9 000 r/min高速离心收集沉淀，弃上清，沉淀尽量风干。加约18 mL水溶解沉淀(有时需搅拌过夜)，此时形成黏稠溶液，为GXM及GalXM多糖混合物。

多糖浓度的测定 采用苯酚硫酸法测量多糖的含量，首先配制1%的葡萄糖，绘制标准曲线:取6个玻璃管，每管加蒸馏水2 mL，按顺序每管相应加入 1%的葡萄糖 0、5、10、20、40、80 μL，然后加入新鲜配制的6%的苯酚1 mL，混匀，再迅速加入5 mL浓硫酸(注:加浓硫酸时应迅速直接加入玻璃管中，不应沿管壁加入)，反应过程会释放大量热量，可将玻璃管置23℃水浴降温，20 min后于490 nm测量光密度，绘制标准曲线。同时取待测样品10、20、40 μL 按相同方法测量光密度值，取平均值测算多糖含量。

CTAB沉淀GXM 常温时在上述获得的多糖溶液中加入2 mL 2 mol/L的NaCl(使NaCl终浓度为0.2 mol/L)，然后缓慢加入0.3%的 CTAB，边加边搅拌，CTAB用量应为多糖含量的3倍，如100 mg多糖溶液应加入0.3%的 CTAB 100 mL(=300 mg CTAB)，为确保GXM被完全沉淀，提高效率，实际操作中CTAB用量高于理论值，直至无新沉淀产生为止。9 000 r/min离心收集沉淀，沉淀使用10%乙醇洗一遍，风干，此为 CTABGXM复合物。然后加12 mL 1 mol/L的NaCl溶解沉淀，再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀溶液中的GXM，此时 CTAB仍存留于溶液中，9 000 r/min高速离心 30 min，收集沉淀 (GXM)，用 2 mol/L的NaCl溶解沉淀，溶解需过夜或数日，可用超声波短暂超声，有助于GXM溶解［3］，此时会形成极其黏稠溶液，似甘油。

GXM缓冲液的交换 取GXM溶液加至10KD的透析袋中，密封，将透析袋置于1 mol/L NaCl于4℃透析1 d，再将透析液换成双蒸水透析1周，每天换液，直至形成清亮的溶液，最后再用PBS透析1 d，将GXM溶液置换成PBS，酚硫酸法测量浓度后存于-80℃备用。

DEAE离子交换层析鉴定GXM 离子交换层析之前将GXM缓冲液交换为0.01 mol/L的磷酸钠 (pH7.1)，然后过DEAE琼脂糖凝胶CL-6B柱，用磷酸钠缓冲液清洗柱子，用0.01 mol/L的磷酸钠/0.3 mol/L的 NaCl洗脱结合的 GXM，每1 mL洗脱液使用苯酚硫酸法测量490 nm的OD值，绘制成洗脱峰。

GXM与巨噬细胞共孵育 实验前4 d给予小鼠腹腔注射硫羟乙酸肉汤2 mL，实验前1 d脱颈处死小鼠，用含10%胎牛血清的DMEM反复冲洗腹腔，离心收集细胞，红细胞较多时使用Tris-NH4Cl破红处理，计数，106/孔铺6孔板，孵箱中培养24 h，轻轻吹打去除悬浮细胞，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。加入纯化的 GXM，使其终浓度为30 μg/mL，阴性对照组加入与GXM同体积的PBS(磷酸盐缓冲液)，阳性对照组加入200 ng/mL的 LPS(脂多糖)，继续培养72 h。

Western blot鉴定 培养的巨噬细胞用2 mL PBS(pH7.4)清洗两遍，加蛋白裂解液于冰上裂解20 min，BCA法测定浓度后调整蛋白浓度一致行SDS-PAGE电泳，随后以100 V恒电压于4℃ 90 min转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶的TBST室温封闭2 h，抗MR一抗室温孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，HRP标记的抗羊IgG二抗室温孵育2 h。TBST洗膜15 min、3次，然后加入ECL化学发光底物作用1 min，置暗室曝光显影并拍照。

2 结 果

2.1 多糖含量的测定

首先我们用酚硫酸法测量了不同含量的葡萄糖在490 nm的光密度值，纵坐标为糖含量，横坐标为OD值，绘制了标准曲线 (见图1)，得到了多糖含量的计算方程:Y=690.6X-68.91，Y代表多糖含量(μg)，X代表OD值。待测样品3管，分别测其OD 值为 0.159，0.227，0.351，换算浓度分别为 4.09，4.39，4.34 mg/mL，取平均值为4.27 mg/mL，多糖溶液体积为18 mL，表明我们从1 L培养上清中获得了GXM及GalXM多糖混合物77 mg。

2.2 GXM含量的测定

多糖经CTAB特异性沉淀GXM，再使用乙醇沉淀CTAB-GXM溶液中的GXM，透析后最终获得11 mL GXM 溶液，同样取 3 管 (40 μL、80 μL、160 μL样品)使用酚硫酸法测量其浓度，分别为2.82、3.08、3.1 mg/mL，取平均值为 3 mg/mL，获得了约33 mg的GXM，得率为42.9%(33/77)与Cherniak R等人报道一致［3］。但Wozniak等报道每升培养上清中可获得高至200 mg的GXM［4］，我们的纯化效率稍微有点低，这可能是因为乙醇沉淀的时候没有加醋酸钠，在醋酸钠存在的情况下可以增加乙醇沉淀多糖的效率。

2.3 离子交换层析鉴定GXM纯度

根据文献报道［3］，我们使用DEAE离子交换层析初步鉴定了GXM的纯度，由图2可见，GXM洗脱后表现为单一的洗脱峰，表明所纯化的GXM的纯度是比较高的，我们成功获得了高纯度的GXM，为下一步研究打下了基础。

2.4 GXM不影响巨噬细胞甘露糖受体MR的表达

接下来我们通过western blot观察了GXM对巨噬细胞MR表达的影响，我们发现，30 μg/mL的GXM处理巨噬细胞72 h后，MR的表达在蛋白水平与PBS处理的空白对照组相比无明显差异，200 ng/mL的LPS处理72 h的阳性对照组MR的表达明显下降(见图3)，表明MR的表达不受GXM的调节。

图1 酚硫酸法测量碳水化合物含量曲线图 图2 离子交换层析鉴定GXM纯度曲线图 图3 Western blot鉴定GXM对巨噬细胞MR的表达的影响Fig.1 Measurement of polysaccharide concentration by phenol sulfuric method Fig.2 Identification of GXM by Ion-exchange chromatography Fig.3 Western blot identification the role of GXM in regulating MR expression in macrophages，GAPDH was used as the reference gene

3 讨 论

GXM的分离和纯化在国外多个实验室均有报道，一般均采用乙醇及CTAB沉淀法，但是国内尚缺乏该方面的研究报道。Cherniak［3］等人报道采用高压或福尔马林处理隐球菌可提高GXM的产量，同时也报道了单纯乙醇沉淀多糖的效率是最低的，丙酮与乙醇联合使用可以明显提高纯化效率。另使用乙醇及醋酸钙沉淀法可获得最大产量，但因为醋酸钙易形成沉淀，影响后续实验的进行。我们也曾采用过Wozniak［4］等人报道的方法纯化GXM，即乙醇沉淀的时候同时加用醋酸钠，沉淀的多糖含量明显高于单纯乙醇沉淀法，但沉淀很难溶解，一方面是因为GXM-GalXM混合物本身难溶，另一方面是由于醋酸钠在乙醇沉淀的时候也容易形成沉淀，此时往往需要加冰醋酸溶解沉淀。对于一般实验而言，不使用醋酸钠也能达到所需要的产量。另外，CTAB在低温的时候难于溶解，因此实验过程中尽量控制在室温，避免CTAB低温形成沉淀影响最终实验结果。如果透析完后GXM浑浊，表明CTAB没有完全去除，此时需用1 mol/L的NaCl重新透析，以便将残余的CTAB清除干净。若需要做免疫学相关实验，尚需要测量GXM的内毒素含量，实验过程中为了防止内毒素污染，应尽量使用一次性实验器材，使用超纯无内毒素水。

GXM可从新生隐球菌和格特隐球菌(血清型A-D)中分离纯化，是隐球菌荚膜的重要组成部分，是毒性因子之一，除了抗吞噬、诱导免疫抑制外，在隐球菌脑膜炎发病中，有荚膜株比无荚膜株可以更快地穿过脑血管内皮细胞，并且在隐球菌穿过血脑屏障后，荚膜多糖的大小和结构都发生了变化［5］，表明荚膜在隐球菌病发病中具有多方面的功能。GXM还可以通过Fas配体诱导巨噬细胞凋亡［6］，可以抑制白细胞的迁移［7］、损害粒细胞抗隐球菌活性［8］，也可以诱导或抑制机体产生多种细胞因子，其中有的报道GXM能促进TNF-α的产生［9］，也有报道 GXM 能抑制 TNF-α 的产生［2］。因此有关GXM的生物学功能尚未完全明确，需进一步研究。

甘露糖受体MR也叫CD206，是一大小为175 KD的跨膜糖蛋白，不仅表达于巨噬细胞，还表达在未成熟树突状细胞 (dendriticcells，DCs)、视网膜上皮细胞及肝脏内皮细胞等［10］。DCs通过MR识别新生隐球菌甘露糖蛋白 (mannoprotein，MP)，内吞并递呈甘露糖蛋白抗原给T细胞，诱发机体的抗感染免疫［11］。我们的前期实验发现新生隐球菌能下调DCs和巨噬细胞MR的表达，鉴于MR在抗隐球菌感染免疫中的重要作用，我们推测隐球菌下调MR的表达有可能是其逃逸机体免疫应答的一个新机制［12］。因此我们观察了新生隐球菌GXM对巨噬细胞甘露糖受体MR的表达影响。实验结果表明GXM不能下调MR的表达，说明隐球菌可能是通过其他荚膜或菌体成分诸如甘露糖蛋白等下调MR的表达的。关于隐球菌下调MR表达的具体机制尚需进一步研究。

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