应用基质辅助激光电离飞行时间质谱快速鉴定临床酵母菌

靳颖 杨爽风 王俊妨 刘锦 崔云涛 周鑫 赵化冰

(1.武警后勤学院附属医院检验科，2.武警后勤学院职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162)

随着广谱抗生素的广泛应用，器官移植、介入治疗等技术的开展，免疫功能低下患者日益增多，真菌感染在临床上越来越常见。其中，白念珠菌占血源性真菌感染的半数以上，非白念珠菌如热带念珠菌等的感染比例也在升高［1］。传统的实验室检测方法往往鉴定周期长、操作繁琐、技术要求高，往往延误临床的诊断和治疗。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是应用于微生物快速检测的一项新技术。不同的病原菌经MALDI-TOF-MS检测可以形成特异性的指纹图谱，建立这些病原菌的图谱库，将待测病原菌的质谱图与已有质谱图库进行比较，即可确定病原菌种属［2］。为探讨MALDI-TOF-MS用于快速鉴定临床分离的酵母菌的可行性，特进行本研究。

1 材料与方法

1.1 实验仪器设备

MALDI-TOF-MS Auto FlexⅢ及其配套的MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统 (德国Bruker公司)，37℃二氧化碳细菌培养箱 (日本三洋)，1 μL、100 μL、1 mL 移液器 (德国 Eppendorf公司)，VITEK 2-compact全自动微生物鉴定仪 (法国梅里埃公司)。

1.2 菌株

150株酵母菌均为本实验室临床分离株，质控菌株为白念珠菌ATCC 90028、光滑念珠菌ATCC 90030、近平滑念珠菌 ATCC 90018、热带念珠菌ATCC 90874(购于卫生部临检中心)。

1.3 培养基与试剂

胰大豆蛋白胨肉汤 (Tryptic Soy Broth，TSB，OXOID公司)，沙堡弱琼脂 (OXOID公司)，哥伦比亚血琼脂(天津金章公司)，真菌鉴定卡 (法国梅里埃公司)，MALDI-TOF-MS分析基质溶液与校准肽 (Sigma公司)。

1.4 菌株活化

将保存的菌株与质控菌株于TSB肉汤中37℃恢复培养16 h，接种于沙堡弱琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板37℃培养24～48 h。

1.5 MALDI-T0F-MS检测程序

靶板制备 将分离后的纯菌株经色谱纯无水乙醇灭活，色谱纯70%甲酸裂解，加入乙腈抽提后，超声破碎细胞5 min，高速离心吸取上清与1 μL基质(50%乙腈+2.5%三氟乙酸配制饱和的α-氰基-4-羟基肉桂酸)混匀点靶，每株菌点4个靶点，在空气中自然晾干后上质谱仪测定。每个点的测定时间小于5 min，靶板可以洗涤和重复使用。

MALDI-TOF-MS分析条件 紫外337 nm氮气激光，激光能量设置刚好能采集到有效的质谱峰，正离子检测方式，用标准混合肽做质量校正后，在分子量2 000～19 950 m/z内采集信号，选取信噪比＞5，信号强度较好的MSP(Main Spectral Projection)图谱，经MALDI Biotyper软件归依化分析后添加至原有数据库。

MALDI-TOF-MS得分标准 临床菌株的质谱用标准菌株库和MALDI BioTyper软件进行分析，专用的计算机程序来计算质谱的负对数得分为0～3，得分＞2.0的时候在种的水平上的鉴定被完全接受，得分在1.8和2.0之间的菌株在种水平上的鉴定已经足够准确，得分在1.7以上的菌株在属的水平上被接受。

1.6 VITEK 2-compact生化鉴定

在仪器配套的一次性塑料试管中加入3 mL 0.45%的无菌NaCl溶液，把活化后的纯菌株溶于其中，配制成1.8～2.2麦氏单位的菌悬液，将酵母菌(YST)鉴定卡插入菌液管中。把装载试管和鉴定卡的载卡架扫描条码后放入VITEK 2-compact仪器中，按照仪器操作规程进行操作，18～24 h后电脑自动传输实验结果。

1.7 基因序列测定

应用鉴定仪和MALDI-TOF-MS鉴定结果不一致的酵母菌，按照Solarbio真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，操作严格按照说明书进行。提取好的DNA送华大基因公司进行测序，引物序列:5'-TCC GTAGGT GAA CCT GCG G-3'和5'-GCT GCG TTC TTC ATC GATGC-3'［3］。基因测序结果与基因库进行比对。

2 结 果

2.1 VITEK 2-compact生化鉴定结果

严格按照VITEK 2-compact全自动微生物鉴定仪的标准操作程序进行操作，鉴定的150株酵母菌中共有108株为白念珠菌，16株为热带念珠菌，12株为光滑念珠菌，2株克柔念珠菌、近平滑念珠菌和挪威念珠菌各1株，还有10株为不能确定的真菌菌种。

2.2 MALDI-TOF-MS 检测结果

150株酵母菌用MALDI-TOF-MS进行检测，不同菌种各有其特征质谱峰 (见图1)，其中108株鉴定为白念珠菌，18株为热带念珠菌，16株为光滑念珠菌，3株克柔念珠菌，2株近平滑念珠菌，3株挪威念珠菌。与VITEK鉴定仪检测确定的140株结果一致，VITEK鉴定仪不能确定的10株经基因序列测定结果也与MALDI-TOF-MS检测一致 (见表1)。

2.3 150株酵母菌质谱得分

150株酵母菌中有141株质谱得分＞2.0，8株得分在1.8 ～2.0，只有1 株 ＜1.8(见表2)。MALDI-TOF-MS鉴定符合率在种的水平上为94%(141/150)，属的水平上为100%。

3 讨 论

临床上由于酵母菌和类酵母菌引起的严重感染不断增加，尤其是在免疫力低下的患者中。在美国，念珠菌已经成为了引起院内血流感染的第四大病原菌。每年全世界约有7 280万的念珠菌的条件致病患者，其引起的死亡率为33.9%［4］。近年来多种不同机制的抗真菌药可以被临床应用，因此快速可靠的鉴定成为了治疗真菌感染的关键。快速准确地鉴定临床标本和患者周围环境中的真菌，也是医院管理中最关注的和有效控制疾病发展的依据，尤其是在病原微生物感染暴发流行的情况下。

图1 白念珠菌 (a)、热带念珠菌(b)、光滑念珠菌 (c)、近平滑念珠菌(d)、克柔念珠菌 (e)和挪威念珠菌 (f)在MALDI-TOF-MS(m/z 2，000 to 12，000)的不同图谱Fig.1 MALDI-TOF-MS spectra(m/z 2，000 to 12，000)of Candida albicans(a)，Candida tropicalis(b)，Candida glabrata(c)，Candida parapsilosis(d)，Candida krusei(e)，and Candida norvegensis(f)revealing differences among the species

表1 150株酵母菌鉴定结果Tab.1 Identification of 150 isolated yeast strains

表2 150株酵母菌MALDI-TOF-MS得分情况Tab.2 MALDI-TOF-MS Scores of 150 isolated yeast strains

目前，已经发现100多种对人类致病的酵母菌和类酵母菌。用传统的生物型鉴定方法来鉴定不断变异的致病真菌既困难又耗时，且最后可能得不到结果，尤其是对于不常见的酵母菌。现在广泛应用商业性的科玛嘉显色培养基、生化反应实验或酶类实验来鉴定酵母菌，虽能准确鉴定大部分的酵母菌，但对不常见的菌株由于一些局限性有可能鉴定不出来和鉴定错误。分子诊断方法为酵母菌的鉴定提供了一个比传统生物学方法更可靠的方法，但DNA分子技术，如26SrRNA或实时荧光PCR成本高，耗时长［5-6］，这些方法虽有很高的准确性，但它们需要对实验条件进行摸索和花费昂贵的费用。在临床和实验室中，除了生化方法和分子生物学方法，质谱分析现在也应用于区分微生物，MALDITOF-MS可以准确快速地鉴定病原微生物，包括革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌和酵母菌等［7-8］，该技术操作快、消耗低、重复性好且种属图谱不随着培养时间、生长条件、溶剂选择而改变［9］。

MALDI-TOF-MS的基本原理是将微生物样品与等量的基质溶液混合或分别点加在样品的靶盘上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶;利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，样品离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器进行质量分析，将检测到的离子峰为纵坐标，离子质荷比(m/z)为横坐标，形成质量图谱;通过软件分析比较，筛选并确定出特异性指纹图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定［10］。从培养基上取单个菌落后，实验的每个分离株的操作时间只需要3 min，3 h可以做96个标本。

本研究中，我们对MALDI-TOF-MS鉴定临床常见的酵母菌株进行了评价，目的是确定其是否适合酵母菌的快速鉴定。实验的所有菌株平行测定4次，每份标本在靶板上点4个点，因为89.6%和97.4%的菌株分别在第一个点和前2个点上能正确鉴定［11］。本研究的结果与Marklein等和van Veen等的研究结果相一致。Marklein等［12］用18株标准菌株建库，267株临床菌株进行应用评价，所有的标准菌株和92.5%的临床菌株能正确鉴定出来，当合适的标准菌株加入到菌库中，所有的临床分离菌株都能正确鉴定出来。van Veen等［13］鉴定了80株酵母菌，在属的水平上共有97.5%的菌株能被鉴定出来，在种的水平上87.5%的临床菌株能被正确鉴定，大部分没有鉴定的菌株是因为菌库不够完整。本实验中MALDI-TOF-MS对150株临床酵母菌在属的水平上100%可以被正确鉴定出来，在种的水平上的鉴定符合率为94%。在早期和现在的研究中，MALDI-TOF-MS不能正确地鉴定菌株是因为数据库中标准菌株的图谱有限，质谱峰数据不充分导致得分较低，还有就是菌库中没有这些菌株。补充数据库后，所有的分离株都被明确地鉴定出来。基于MALDI-TOF-MS的鉴定方法具有很好的可重复性和准确性，并且其检测成本较低，实验准备时间和出报告的时间很短，我们认为MALDITOF-MS可以被快速地应用于微生物实验室。

总之，MALDI-TOF-MS用于鉴定临床酵母菌快速准确。目前的研究清楚地证明了MALDI-TOFMS可以作为一个快速可靠鉴定真菌的工具应用于临床实验室，而且这个技术已经应用于临床细菌学的不同领域。利用其人性化的软件，MALDI-TOFMS的操作不需要专门的工程师，这是一个经过几天短期的培训就可以操作的实验室技术，其低成本的耗材平衡了设备投资和保养费用。把该技术应用到实验室的常规检测流程中，不用生化鉴定我们在几个小时之内就可以初步鉴定大部分的细菌和真菌。但应用一种新的鉴定系统，菌库的建立是非常重要的，菌库建立需要提供一个适宜的标准操作程序和比较全面的人类病原菌的图谱数据库。相信随着相关技术的改进，MALDI-TOF-MS将成为临床实验室鉴定微生物的有力工具。

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