生物降解作用对烷基萘异构体分布的影响及其控制因素

俞 頔, 崔志松, 沈冰芳, 李馨子, 郑 立, 孙永革,3*

(1. 浙江大学 地球科学系, 浙江 杭州 310027; 2. 国家海洋局 第一海洋研究所 海洋生态研究中心, 山东 青岛266061; 3. 中国科学院 广州地球化学研究所 有机地球化学国家重点实验室, 广东 广州 510640)

0 引 言

萘与萘系物是一类常见的多环芳烃(图1), 因萘环的疏水性导致其易于被微粒所吸附而广泛存在于环境中[1], 其毒性和致癌性已备受关注[2–3]。萘的烷基取代异构体不仅是沉积有机质(包括石油、煤)的主要成分之一, 而且也是石油化工生产和加工过程中的主要产物之一, 如1,6-二甲基萘、1,2,5-三甲基萘、1,2,3,5-四甲基萘、1,2,3,5,6-五甲基萘等[4], 其生物致毒性与其母体分子相当或更强, 由此引起的污染一旦扩散到环境中, 将对区域生态环境造成巨大威胁[5]。

图1 萘的分子结构和碳位编号Fig.1 Chemical structure and numbering of the naphthalene carbon skeleton

自然环境中, 烷基萘类多环芳烃的降解主要依靠细菌和真菌的生物作用[6], 因此, 研究烷基萘在表生环境中的降解过程、效率、影响因素对于污染环境的生物修复具有重要指导意义。烷基萘的生物降解研究最早见于石油地球化学领域。20世纪 80年代初, Volkman et al.[7]利用色谱质谱技术, 研究了生物降解作用对石油中甲基萘和二甲基萘异构体分布的影响, 发现生物降解速率与烷基萘的取代基数量和位置有关, 取代基数量越多, 越难被降解; 相对于α位取代萘, β位取代异构体更易被降解。Fisher et al.[8]的研究从实验现象上概括了烷基萘存在1号和 6号位取代基的异构体易遭受生物降解的现象,但未涉及烷基萘生物降解现象控制因素的本质。Huang et al.[9]通过一个自然降解油藏剖面的系统分析, 给出了烷基萘的生物降解顺序, 指出烷基化程度越高的异构体, 抗生物降解程度越高, 同时指出,烷基萘生物降解过程不同于热力学降解过程, 热力学稳定的异构体更易遭到生物降解。所有这些研究表明, 烷基萘不同异构体之间的生物降解存在显著差异性, 而导致这种差异性的根本原因可能与烷基萘异构体分子结构有关, 内能低且结构紧密的异构体相对容易被生物降解[10]。最近, Ostojić et al.[11]利用目标化合物化学势、偶极距、极化率等与生物降解率的关系, 通过密度泛函理论和极化连续模型,对三甲基萘各异构体的极化率和偶极矩进行了计算,结果显示, 三甲基萘各个异构体电离能基本相等,而静态偶极极化率平均值从 α,α,α-三甲基萘到 β,β,β-三甲基萘的取代基变化过程中不断增加, 说明色散力和电感力对三甲基萘异构体和细菌特定酶的活性位点的亲和力有影响。据此, Ostojić et al.[11]提出可以利用三甲基萘异构体极化率对其生物降解率进行预测, 并从理论上给出了表生环境中烷基萘异构体的可能降解顺序。

尽管 Ostojić et al.[11]的预测结果与地质油藏所观察到的烷基萘降解过程有较好的相似性, 但与表生好氧环境相比, 地质油藏中石油的降解主要属于厌氧过程[12], 因此, Ostojić et al.[11]的推测是否存在于表生环境仍是一个未知数。本研究利用受溢油污染海滩不同时间序列残留石油样品, 通过烷基萘的定量分析, 主要探讨：(1) 三甲基萘和四甲基萘各异构体在不同时间序列中的含量水平; (2) 三甲基萘和四甲基萘各异构体降解速率变化特征及其与取代基位置、数量的相关性。研究结果不仅是对Ostojić et al.[11]理论预测的实际验证, 同时对表生环境中萘系物类多环芳烃污染的生物修复效果评价具有重要指导作用。

1 样品和实验

1.1 样品背景

原油样品取自中国大连“七一六”溢油事故所污染的砾石滩, 研究人员[13]发现此残留砾石滩时离“七一六”溢油事故已有34天, 为了获得一组自然降解序列, 该砾石滩被要求继续保留近两个月, 分别在发现后的第0天、3天、15天、32天和52天采集残留溢油样品, 并将其带回实验室冷冻处理待用。

1.2 实验条件

分别对第0天、3天、15天、32天和52天残留溢油样品用二氯甲烷浸泡, 并过无水硫酸钠柱以除去水、泥、砂等杂质, 获得纯净残留油。用过量石油醚沉淀获得沥青质组分, 非沥青质组采用硅胶/氧化铝层析柱, 依次以石油醚、苯、乙醇作洗脱液,获得饱和烃、芳烃、非烃三个组分。

饱和烃和芳烃组分进行气相色谱-质谱分析, 仪器为Agilent 5975C气相色谱质谱联用仪。色谱柱为弹性石英毛细柱(Agilent DB-1M, 60 m×0.32 mm×0.25 μm)。升温程序为始温60 , ℃恒温3 min, 然后以3 /min℃的升温速率升至300 , ℃恒温30 min。进样口温度为280 , ℃载气为氦气, 流速为1.0 mL/ min,恒速。EI模式, 电离能量为70 eV, 离子源温度200 ℃。全扫描检测, 质量扫描范围为 50～550 u。烷基萘异构体的鉴定依据文献和保留时间确定[1,4], 用氘代菲内标定量。

2 结果和讨论

2.1 生物降解作用程度

表生环境中, 光氧化降解、水洗、挥发和生物作用对原油中各组分分布均有影响, 导致原油的物理性质和化学组成发生变化, 但这些过程发生的机理有所不同, 使得原油的最终面貌表现出差异性。考虑到原油低分子量组分的挥发性, 研究中没有对萘、甲基萘、二甲基萘作讨论(实际上萘和甲基萘已在检测限以下)。水洗作用主要是选择性地溶解亲水性有机化合物, 如芳香烃、极性杂原子化合物等。随着原油在海滩暴露时间的增加, 研究样品中非烃沥青的含量显著升高, 揭示水洗作用并不是引起原油组分变化的主要原因(表1)。而光氧化降解过程的最大特点是使原油在量上发生显著改变, 但总体烃类色谱特征在光氧化降解前后并不会发生明显变化,特别是不会出现生物降解作用所致的 UCM 鼓包。并且与生物降解作用相比, 光氧化降解对烃类化合物的选择性并不明显, 同一系列化合物不同异构体间分异性较弱。大连“七一六”溢油原始油样含有完整的正构烷烃分布, 以及微弱的UCM分布[14], 而后期所获得样品有着强烈 UCM 特征, 表明其生物降解作用占有主导地位。

表1 各个组分含量百分比和回收率Table 1 Percentage of each component content and recovery

如图2所示, 海滩发现原始溢油样(第0天)显示出重质稠油特征, 正构烷烃几乎消耗殆尽, 气相色谱质谱总离子流图所揭示饱和烃分布特征优势组分为类异戊二烯烃(姥鲛烷和植烷)和环烷烃。众所周知,在轻微至中等强度生物降解过程中, Pr/nC17,Ph/nC18[15–17]可以作为指示参数, 用于判定原油的生物降解程度, 由于样品中nC17和nC18几乎全部消失,而姥鲛烷(Pr)、植烷(Ph)保持相对较高的丰度, 即Pr/nC17、Ph/nC18比值趋于无穷大, 说明样品至少遭受了中等强度的生物降解作用, 根据Peters et al.[15]对生物降解程度的判别标准, 达到 3级降解程度。随着溢油样品在表生环境暴露时间的增长, 油组分中饱和烃和芳烃的相对含量明显变小(表1)。相对于第0天样品和第52天样品的饱和烃、芳烃含量分别下降了18.21%和10.57%, 而非沥青质含量则上升了23.72%。饱和烃中类异戊二烯烃姥鲛烷、植烷降解显著。芳烃组分也开始遭到不同程度的降解, 第 52天后菲和甲基菲的降解率分别为 87.71%和 71.42%,三甲基萘的降解率为 79.24%, 四甲基萘的降解率20.53%(表2)。Fisher et al.[18]在对降解原油、受污染的潮间带沉积物和海底表层沉积物的生物降解研究中, 采用三甲基萘(TBR = 1,3,6-/1,2,4-TMN)和四甲基萘(TeBR = 1,3,6,7-/1,3,5,7-TeMN)比值作为生物降解程度参数, 发现在生物降解等级为 3～5级时三甲基萘比值(TBR)变化显著, 而四甲基萘比值(TeBR)则在生物降解等级为5～6级时才有明显变化。同时,基于三芳甾烷(TAS)的强抗生物降解性, 利用菲与三芳甾烷(P/TAS)的比值[19]和三芳甾烷与芳烃总量(TAS/Aro)的比值[9]也可以用于指示生物降解等级,并且常作为高等级生物降解的指示参数。如表3和图3所示, 为TBR、TeBR、P/TAS和TAS/Aro四组生物降解参数的变化趋势, TAS/Aro和TeBR变化很小, 而 TBR和 P/TAS随降解时间推移变化很大。TAS/Aro曲线较为平稳说明, 样品尚未遭受剧烈生物降解, 三芳甾烷没有实质性消耗, TeBR的微量变化确定了样品总体的生物降解程度不超过5级。

2.2 生物降解作用过程中烷基萘异构体的分布特征

稠环芳烃的生物降解作用在很大程度上取决于其分子结构, 包括化合物的芳环数量, 取代基数量和位置[20]。三甲基萘和四甲基萘异构体的芳环结构相同(同为萘环), 所以烷基取代基数量和位置对其生物降解起主要作用。已有研究表明, 烷基萘同系物的取代基数量越多, 其生物降解抗性越大, 从最易降解到最难降解表现为：二甲基萘 ＞ 三甲基萘 ＞四甲基萘[7–9]。对于有相同数量取代基的烷基萘, 取代基的位置对其生物降解程度影响重大, 如2,3-DMN和1,8-DMN是抗生物降解能力最强的二甲基萘异构体[7], 2,3,6-TMN是最易降解三甲基萘异构体之一[9]。

图 4所示为三甲基萘和四甲基萘分布特征, 发现在降解过程中, 烷基萘各个异构体均存在着不同程度的变化。图5所示为烷基萘异构体取代基数量和位置与其生物降解率之间的关系, 总体上可以观察到三甲基萘和四甲基萘降解率随时间推移而增大的趋势。由图5可知, 四甲基萘在前15天的生物降解作用比较小, 三甲基萘异构体的降解速率明显高于四甲基萘异构体, 揭示取代基数量相对少的烷基萘异构体受生物降解影响较大。同时, 在三甲基萘和四甲基萘中, 各异构体 α位取代基数量越多, 对生物降解抗性越大, β位取代基数量越多, 对生物降解敏感性越强, 与Ostojić et al.[11]计算获得的三甲基萘异构体平均极化率顺序一致。三甲基萘异构体对生物降解的敏感性程度由大到小为：β,β,β- ＞ α,β,β- ＞α,α,β-TMNs, 四甲基萘异构体则表现为：β,β,β,β- ＞α,α,β,β- ＞ α,α,α,β- TeMNs, 较好地反映了烷基萘生物降解作用程度与其取代基位置的相关性。

由图 6可见, 无论是三甲基萘还是四甲基萘,其主要降解过程均发生在 0～32天, 在这之后的 20天中几乎不发生显著变化, 生物降解率趋于平稳。暴露32天后, 三甲基萘各异构体对生物降解作用的敏感程度由强到弱的表现为：2,3,6-、1,2,7-、1,3,7- ＞1,3,6- ＞ 1,2,5- ＞ 1,6,7-+1,2,6- ＞ 1,3,5-+1,4,6- ＞ 1,2,4-三甲基萘, 而至第15天时, 则敏感度差异性更为显著: 1,2,7- ＞ 2,3,6- ＞ 1,3,7- ＞ 1,3,6- ＞ 1,2,4- ＞1,3,5-+1,4,6- ＞ 1,6,7-+1,2,6-、1,2,5-三甲基萘(图 6a)。在这一降解阶段, 1,3,7-、1,2,5-、1,6,7-+1,2,6-TMNs降解速率相对稳定或呈下降趋势, 而1,2,4-、1,2,7-、1,3,5-+1,4,6-TMNs的降解速率明显升高, 导致上述现象的原因可能是1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs存在邻位取代基会使异构体的空间位阻增加而不易被细菌攻击; 而1,2,4-TMN中虽然有存在两个α位取代基和邻位取代基, 但是由于该异构体中存在一个未被取代的环, 增加了细菌攻击机率[7], 破坏异构体结构; 1,3,5-+1,4,6-TMNs的结构有两个α取代基, 且无邻位取代, 故而相对于 1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs其空间位阻较小, 降解速率较高。令人不解的是, 1,2,4-TMN降解速率在32天后逐渐下降, 可能在生物降解过程中存在缓慢轻微的甲基化过程[4], 易生成邻位和对位取代基异构体,但是, 其成因还有待讨论。

图2 饱和烃(a)和芳烃(b)总离子流图Fig.2 The total ion chromatograms of saturated hydrocarbons (a) and aromatic hydrocarbons (b)

表2 类异戊二烯烃、烷基萘、菲和烷基菲化合物含量(μg/mg)Table 2 Content of isoprenoids, alkyl naphthalene, phenanthrene, and alkyl phenanthrene compounds

表3 生物降解参数Table 3 Parameters of biodegradation

同等条件下, 四甲基萘与三甲基萘相比, 生物降解率较低(图 6b), 由于样品遭受的生物降解等级为 3～5级, 四甲基萘生物降解参数(TeBR)变化并不明显, 导致四甲基萘各个异构体的生物降解趋势相对一致。样品在暴露 3天后, 四甲基萘各个异构体的降解顺序(从大到小)为: 1,2,3,7- ＞ 1,3,6,7-、1,3,5,7-、2,3,6,7- ＞ 1,2,3,6- ＞ 1,2,5,6-+1,2,3,5-、1,2,6,7-、1,2,5,7- ＞ 1,2,4,6-+1,2,4,7-+1,4,6,7-TeMNs,而到第15天时, 1,3,5,7-TeMN降解率明显高于其他异构体, 至52天时, 能明显看出α取代数量较多的异构体降解率较低。1,2,3,7-TeMN优先降解的原因可能是其本身内能较低并且7号位置是烷基取代基的三号位和五号位的重合位置, 使其反应活性较高[4],更容易遭到生物攻击所致, 但其优先降解原因仍值得探讨。

2.3 烷基萘生物降解作用控制因素

从本质上讲, 表生环境条件和烷基萘异构体结构这两个因素制约着烷基萘的生物降解程度, 其中外部环境的温度和盐度、pH值等因子是生物降解的先决条件。Bernard et al.[21]认为高盐度油源中低于80 ℃条件下有利于生物降解, 并随着温度的升高生物降解程度减小。Yuan et al.[22]在烷基菲降解中,研究了外部环境对样品生物降解的影响, 发现 30 ℃条件下, pH = 6～8的情况下, 烷基萘的生物降解速率较高。本研究样品采集实验区域为海水冲刷不到的潮上带溢油污染区, 相对干燥且土壤盐度较高, 采集季节为八月, 日平均气温 30～32 ℃, 对微生物生长十分有利。

图3 生物降解参数变化趋势Fig.3 The trends of biodegradation parameters

图4 生物降解原油中三甲基萘(TMNs) (a)和四甲基萘(TeMNs) (b)分布特征Fig.4 The distribution of trimethylnaphthalenes (TMNs) (a) and tetramethylnaphthalenes (TeMNs) (b) in biodegraded oil

图5 三甲基萘(TMNs)和四甲基萘(TeMNs)取代基位置和数量与其生物降解率关系Fig.5 The relationship between substituent position and number of trimethylnaphthalenes (TMNs) and tetramethylnaphthalenes (TeMNs)and their biodegradation rates

在合适的表生环境中, 烷基萘的生物降解程度取决于其自身化学结构特性, 对其生物降解作用起到决定性作用, 表现为以下4个方面: (1) 取代基数量较多的烷基萘化合物对生物降解抗性较强, 由图5可知, 三甲基萘生物降解速率明显高于四甲基萘,与前人[7–9]研究发现烷基萘的生物降解速率趋势相符(从最易降解到最难降解)—— 二甲基萘 ＞ 三甲基萘 ＞ 四甲基萘; (2) 在取代基数量相同的情况下,邻位取代会导致烷基萘分子空间位阻增大, 会导致化合物不易被生物降解, 如图6所示, 1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs存在邻位取代基会使异构体的空间位阻增加而不易被细菌攻击; (3) 若烷基取代基都分布在同一环上, 另一个未被取代的环会遭受细菌攻击而被降解[4], 如1,2,4-TMN, 同环取代会导致整个烷基萘分子极化程度增加, 增加了细菌攻击未取代环的几率; (4) 烷基萘α位取代比β位取代抗生物降解能力更强。萘分子中的α位比β位的碳原子电子云密度高, α位取代基与其相邻碳原子上的氢原子间距较小, 空间位阻较大[23], 导致α取代烷基萘不易遭到细菌攻击, 由本研究可知, 三甲基萘表现为: β,β,β- ＞ α,β,β- ＞ α,α,β-TMNs, 四甲基萘异构体则表现为: β,β,β,β- ＞ α,α,β,β- ＞ α,α,α,β-TeMNs,印证了α取代比β取代烷基萘抗生物降解能力更强[4]这一观点。因此, 表生环境现场实验较好地再现了烷基萘的取代基数量和位置共同影响其分子空间位阻和极化程度, 控制着烷基萘异构体的生物降解作用效率。

图6 三甲基萘(a)和四甲基萘(b)生物降解率与时间关系Fig.6 The variation in biodegradation rates of trimethylnaphthalenes (a) and tetramethylnaphthalenes (b) with time

3 结 论

烷基萘异构体的生物降解作用是多种因素共同控制的结果, 包括取代基数量和位置。取代基数量越多抗生物降解能力越高, 即(从最容易降解到最难降解)三甲基萘 ＞ 四甲基萘。而拥有相同取代基数量的烷基萘, 其降解规律与取代基位置有关。根据对三甲基萘、四甲基萘的生物降解作用分析, 得知1,2,7-三甲基萘(αββ 取代)、2,3,6-三甲基萘(βββ 取代)、2,3,6,7-四甲基萘(ββββ 取代)、1,2,3,7-四甲基萘(αβββ 取代)和 1,3,5,7-四甲基萘(αβαβ 取代)的降解效果显著, 这可以说明, 生物降解程度与化合物空间位阻有关, 即 β取代较多且空间位阻小的烷基萘异构体易降解。

感谢浙江大学地球科学系谢柳娟博士在实验过程中的指导和帮助。感谢审稿者提出的意见和建议,提高了文章的质量。

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