木霉素标准样品的研制

朴怡情，申屠旭萍，叶子弘

(中国计量大学，浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018)

木霉素是单端孢霉烯类化合物的一种，可抑制真核生物细胞核糖体的转肽酶，从而影响蛋白质的合成以及遗传信息的传递，因而是一种蛋白质合成抑制剂[1,2]。同时，木霉素还能抑制多种植物病原真菌，具有广阔的生防应用前景[3-5]。有关木霉素在医学方面的应用，国外早在20世纪70年代就有相关报道[1]，国内相关木霉素的研究报道主要集中在对农作物病原真菌的生物防治[4]。

目前国内外未见木霉素标准样品研制的报道，也无木霉素标准样品可以购买，使得相关木霉素的深入研究和开发受到了极大的限制。为此，全国标准样品技术委员会批准了木霉素国家标准样品的研制。我们参照ISO Guide 35:2017，依据GB/T15000.3-2008标准样品系列工作导则[6]，研制了木霉素的国家标准样品。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

旋转蒸发仪(Buchi)，气相色谱仪(Agilent GC-6890)，HYG-B恒温摇床(太仓市实验仪器厂)，TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)，WFH-203B型暗箱式紫外透射仪(上海精科实业有限公司)，AB204-N电子天平(瑞士梅特勒公司)。乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂，均为分析纯试剂(杭州常青化工有限公司)；乙酸乙酯(GC检测用，色谱纯)，硅胶100-200目(青岛海洋化工厂)，GF254硅胶板(山东烟台汇友硅胶有限公司)。

1.2 木霉素样品的制备

以脐孢木霉菌(Trichodermabrevicompactum)发酵代谢产物为原料，分别经乙酸乙酯和正丁醇溶剂提取后浓缩干燥获得粗品，采用硅胶柱层析多次分离纯化获得纯度不低于99%的木霉素纯品。其中脐孢木霉菌发酵代谢产物获得采用摇瓶发酵法收集：在250 mL三角瓶中装量60 mL液体发酵培养基(20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L牛肉浸膏，0.001 g/L ZnSO4·7H2O和0.01 g/L NH4Cl)，灭菌，待冷却后每培养瓶接种1 mL脐孢木霉菌孢子悬液(含孢子为106个/mL)，置于恒温摇床上培养，培养温度28 ℃、摇床转速180 r/min，培养时间3 d。发酵液在5000 r/min下离心10 min，取上清液备用。多批次发酵，合并收集代谢产物约80 L，浓缩、干燥后供后续分离。

1.3 定性分析

采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)对所制备的木霉素进行结构确认。

1.4 定值分析

1.4.1 GC色谱条件

仪器：Agilent 6890气相色谱仪；色谱柱：HP-5弹性石英毛细管柱(以5%苯基甲基硅氧烷为固定液，30 m×320 μm×0.25 μm)；检测器：氢火焰离子检测器(FID)，检测器温度270 ℃；进样口温度250 ℃；柱温度：程序升温，初始温度100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温至260 ℃保持5 min；载气：氮气；流速1.5 mL/min；不分流，以乙酸乙酯为溶剂[7]。

1.4.2 GC-TOF分析条件

仪器：质谱分析采用GCT-Premier GC-TOF质谱仪(Waters公司)测定，GC条件同1.4.1。质谱条件：电离方式为EI，电离能量为70 eV，离子源温度为280 ℃，接口温度为280 ℃，扫描范围m/z 5-560 amu。

1.4.3 样品溶液制备

称取木霉素样品，用乙酸乙酯色谱纯溶解，质量浓度在400～2 000 μg/mL范围内，现配现用。

1.5 均匀性检验

对同一批制备的木霉素样品进行分装，按照标准样品工作导则[6]第7章均匀性研究的要求进行。抽样数目为12个，按3种程序分别从每瓶中称取1.0 mg样品3份，每份样品加色谱纯乙酸乙酯溶解，GC法检测木霉素纯度。3次的抽样顺序为1，3，5，7，9，11，2，4，6，8，10，12号瓶；12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1号瓶；2，4，6，8，10，12，1，3，5，7，9，11号瓶。按照1.4.1项GC色谱条件对每个样品重复测定3次。用方差分析法对检测数据进行分析，以判断标准样品是否均匀。

1.6 稳定性检验

本研究通过检测木霉素样品纯度的变化来研究其稳定性，以便确定有效期。样品分装后，于-20～-18 ℃保存。本研究以一年为期，对制备的木霉素样品取样检验，每份试样以测定3次的平均值为其定值结果。

2 结果与讨论

2.1 木霉素的结构鉴定

2.1.1 元素分析

根据JY/T 017-1996元素分析仪方法通则进行测试。分子式为C17H24O4，计算值：C 69.84%，H 8.27%，O 21.89%。实际测定值：C 69.88%，H 8.27%，O 21.91%。

2.1.2 紫外(UV)光谱分析

溶剂为CH3OH，紫外可见光区(200～800 nm)全波长扫描，在205 nm处有吸收。

2.1.3 红外(IR)光谱分析

溴化钾压片，红外光谱(IR，cm-1)：2 969.21-CH3反对称伸缩，2 839.02-CH伸缩，1 732.92-酯键伸缩，1 243.04-羟基碳和甲基C-C伸缩。

2.1.4 高分辨率质谱(MS)分析

质谱条件：电离方式为EI，电离能量为70 eV，离子源温度为280 ℃，接口温度为280 ℃，扫描范围m/z 5～560 amu。测得木霉素相对分子质量为292.167 0。

2.1.5 核磁共振(NMR)分析

以氘代氯仿为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，核磁数据归属见表1。

表1 木霉素的核磁共振数据

将木霉素的MS和NMR数据与文献报道的进行比对，基本一致[5,8,9]，确定该化合物为木霉素，结构式见图1。

图1 木霉素结构式

2.2 纯度分析

2.2.1 GC纯度分析

参照1.4.1GC分析条件，对木霉素样品进行纯度分析，结果见图2。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一法定量，经积分，木霉素纯度为99.82%。

图2 木霉素GC图

2.2.2 GC-TOF纯度分析

参照1.4.2 GC-TOF分析条件，对木霉素样品进行纯度分析，结果见图3。从该图可知为单一峰，说明木霉素纯度较高。

图3 木霉素GC-TOF图

2.3 均匀性试验

将木霉素样品进行分装后，对其进行纯度均匀性检验，检测结果见表2、表3。

表2 木霉素标准品纯度均匀性检验结果

表3 方差分析结果

从表3可见，以υ1(即组间)=11及υ2(即组内)=24，F=MS间/MS内=1.42

均匀性检验的不确定度ubb=sbb=0.003 706。

2.4 稳定性试验

木霉素样品在-20～-18 ℃条件下保存，分别于0，1，2，3，6，9，12个月时各取3个样品进行稳定性检验，按照1.4.1项色谱条件，每份样品连续进样3次，用峰面积归一化法求出纯度，结果见表4。

从上表4数据看，测得的木霉素纯度平均值在测定时间内随时间的变化不明显，同时根据GB/T 15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求，以直线模型作为经验模型，分别采用t检验和F检验分析稳定性检验获得的数据。具体计算如下：

表4 稳定性检验试验结果

t检验斜率计算

直线的截距

直线上的点的标准偏差

取其平方根s=0.009 07，与斜率相关的不确定度

自由度为n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子等于2.571。

由于

|b1|

所以，斜率变化不显著。因而木霉素样品在一年内是稳定的。

有效期t=12个月的长期稳定性的不确定度为

u=sb×t=0.000 830 2×12=0.009 962。

扩展不确定度u1st=2u=0.009 962×2=0.019 924。

F检验：上表数据(0～12个月)经线性拟合，结果见表5。

表5 线性回归方差分析表

线性回归方差分析：从表5的数据可以看出，在测定时间范围内(12个月)直线回归方程的拟合度较好。经直线回归的方差分析得到F=2.29小于方差分析临界值F0.05(1,5)=6.61。

由此确定木霉素样品在-20～-18 ℃保存条件下，至少在12个月内是稳定的。

2.5 定值结果及其不确定度评定

2.5.1 定值结果

木霉素标准样品定值的方法根据GB/T 15000-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定，选择多个实验室采用一种方法协作进行测定。为此我们随机抽取16瓶样品，分别向获得国家或部门认可的具备资质的8家实验室送样，每个定值实验室送2瓶，每瓶平行测定3次。定值实验室将样品配成一定浓度的溶液，气相色谱法测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。木霉素纯度定值结果汇总表如表6所示。

表6 8家实验室木霉素纯度定值数据

表7 8家实验室定值数据方差分析

Table 7 Analysis of variance of 8 laboratory certification data

变差源SS自由度MS组间0.007470.00106组内0.0104400.00026总和0.017847

2.5.2 定值分析的不确定度评定

标准样品特性标准值的测量不确定度u分别由联合定值实验引入的不确定度uchar、均匀性检验引入的不确定度ubb和稳定性检验引入的不确定度ults3部分组成。结合实际研究结果，木霉素标准样品的特性标准值和不确定度计算如下。

2)均匀性检验引入的不确定度ubb=0.003 7%。

3)稳定性检验引入的不确定度ults=1.99%。

标准样品定值结果的不确定度

扩展不确定度

=0.041 6%。

木霉素标准样品的定值结果：木霉素样品的纯度为99.86%，扩展不确定度根据只进不舍的原则统一小数点位数后为0.05%。

3 结 语

按照标准样品工作导则[6]的要求，研制的木霉素标准样品经均匀性检验、稳定性检验，均符合要求，定值结果为(99.86±0.05)%，达到了天然产物国家标准样品的要求。该标准样品可用于木霉素含量测定、检测方法评定、相关产品的检测与质量控制等。