枣缩果病初侵染互隔链格孢菌抗药性研究

张 敏 ，王 迎 ，史晓梦 ，田红雨 ，甄志先 ，冉隆贤

（河北农业大学a.林学院；b.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000）

枣缩果病是枣生产中最严重的果实病害，现已遍及全国各大枣区。受害的枣果由外向内逐渐出现褐色坏死现象，病组织呈海绵状[1]，于成熟前脱落[2]，无商品价值。据报道，互隔链格孢菌是引起枣缩果病的初侵染病原菌[3]，该病害在河北、河南、山东和山西各大枣区均有大面积爆发的报道[4]，严重影响了枣的品质和产量。

枣缩果病以化学防治为主[5]。许阳等的试验结果表明，异菌脲有明显的防治效果[6]；邢艺林等研究认为，异菌脲和苯甲丙环唑均有明显的防治效果[7]。但是，已有关于生产中存在链格孢属真菌对异菌脲产生抗药性问题的研究报道。Mcphee研究发现了抗异菌脲的互隔链格孢菌突变体[8]；黄思良从自然界中分离得到了抗异菌脲的互隔链格孢菌突变体菌株[9]；Simoneau等报道，甘蓝链格孢菌对二甲酰亚胺类杀菌剂有很强的抗性[10]；Ma从开心果中分离到了抗异菌脲的链格孢属真菌[11]；其它植物病原菌对异菌脲的抗药性也相继被发现[12-17]。另外，互隔链格孢菌对甲基硫菌灵和腐霉利产生抗性也有报道[18-19]。

由此可见，长期单一喷施异菌脲易使链格孢属真菌产生抗药性，而枣缩果病初侵染互隔链格孢菌是否对异菌脲产生抗性尚未见诸报道。为此，本研究选取分离自未使用过异菌脲和苯甲丙环唑枣园的4株枣缩果病菌A. alternata[3]，分别测定了其对异菌脲和苯甲丙环唑的敏感性，从中筛选抗性菌株，并检测其交互抗性。通过交互抗性的分析和林间防治效果的试验，确定林间最适施药方案，以期为枣缩果病菌抗药性的风险评估和治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株：互隔链格孢菌4个菌株CN191、CN192、CN193和CN194，分别于2011年分离自河南新郑和濮阳、河北行唐和唐县的病果。

供试药剂：50%异菌脲可湿性粉剂，由美国富美实公司生产；50%苯甲丙环唑，由青岛泰升生物科技有限公司生产。

1.2 方 法

1.2.1 枣缩果病菌对2种杀菌剂的敏感性的测定

采用生长速率法测定枣缩果病菌对异菌脲和苯甲丙环唑的敏感性。将互隔链格孢菌各菌株置于马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，25 ℃黑暗培养7 d以备用。在超净工作台上，用 0.7 cm 打孔器沿预培养7d的枣缩果病菌菌落边缘打取菌碟，然后，将菌碟接种到分别含有0.002、0.010、0.020、0.100、0.200 mg·mL-1的 异 菌 脲 和 0.01、0.02、0.10、0.20、1.00 mg·mL-1的苯甲丙环唑的PDA培养基中央，每个处理重复3次。将接种后的培养皿放入25 ℃的培养箱中黑暗培养。当对照组菌落直径达到30 mm时，采用十字交叉法测定菌落直径，计算药剂不同浓度处理对各互隔链格孢菌菌丝生长的抑制率[20]。求出毒力回归方程y＝a＋bx，根据方程计算2种杀菌剂抑制各菌株菌丝生长的有效抑制浓度 EC50值（mg·mL-1）及相关系数 r。根据EC50值分析采自同一年份、不同地区的枣缩果病菌对这2种杀菌剂的敏感性。

菌丝生长抑制率(%)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(处理菌落直径－0.7)×100%。

1.2.2 突变体菌株的筛选

在无菌环境下，用无菌水分别配制 100 mg·mL-1异菌脲和苯甲丙环唑母液以备用。制作含有不同浓度梯度的异菌脲和苯甲丙环唑药剂的PDA培养基，其起始浓度设定为0.005 mg·mL-1，并依次将药剂浓度提高到0.01、0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg·mL-1。取浓度为 400 ～ 500 个·mL-1的孢子悬浮液100 μL，分别均匀涂布于含有异菌脲和苯甲丙环唑的培养基上，于25 ℃条件下培养。以涂布无菌水的PDA培养基作为对照。待含有0.005 mg·mL-1药剂的PDA培养基上长出突变体单菌落后，再将突变体菌株转接入PDA 培养基上培养，待其长出孢子后，配制浓度为400～500个·mL-1的孢子悬浮液，取100 μL接入含有相应高浓度的药剂培养基中，依次重复，以培养菌株对异菌脲的抗性，最终得到抗异菌脲的突变体菌株CN194y。

1.2.3 突变体菌株的稳定性检测

将突变体菌株CN194y在不含异菌脲的PDA培养基上连续培养5代后，用打孔器取直径为0.7 cm的菌落块，并以野生型菌株CN194为对照，将其分别接种到含有0.20 mg·mL-1异菌脲和不含异菌脲的PDA培养基中央，置于25 ℃培养箱中黑暗培养5 d后，测量菌落生长的直径。

1.2.4 突变体菌株的致病性检测

在河北农业大学苗圃，选择无枣缩果病的试验地作为接种地。将通过稳定性测试的突变体菌株CN194y的菌碟，刺伤接种在活体的枣果上。试验设2个对照组，其中，第1对照组刺伤接种无菌的PDA培养基，第2对照组刺伤接种野生菌株CN194菌碟。发病后将病果带回实验室分离，并置于含有0.20 mg·mL-1异菌脲的PDA培养基上培养，观察病原菌的生长状况，判定是否为接入的突变体菌株CN194y。

1.2.5 突变体菌株对2种药剂的交互抗性的测定

选取8个抗异菌脲的突变体菌株CN194y，检测苯甲丙环唑对它们的毒力，用药剂对菌株的EC50值表示毒力。分析异菌脲和苯甲丙环唑之间的交互作用。

1.2.6 林间防治试验

将河北省行唐县寺上村施用过异菌脲和苯甲丙环唑的试验地分成9个小区，处理和对照各3个小区，随机分布；2016年7月1日开始，在试验地各小区内分别喷施异菌脲1 000倍液和苯甲丙环唑3 000倍液。选取未施用过异菌脲和苯甲丙环唑的试验地，将其分成12个小区，处理和对照各3个小区，随机分布；2017年6月28日开始，在各小区内分别喷施异菌脲1 000倍液、苯甲丙环唑3 000倍液和两种杀菌剂交替施用。上述各试验均每隔7 d喷药1次，共喷施8次，对照喷施等量的清水。发病率的调查时间分别为发病初期和高峰期。各小区内随机选取发病一致的3株枣树，每个处理9株枣树，每株枣树选择4个枝条进行调查，分别记录喷药枣树的枝条及对照枝条的总果数和病果数，计算发病率和防治效果。

发病率(%)＝(病果总数/调查总果数)×100%；

防治效果(%)＝(对照病果率－处理病果率)/对照病果率×100%。

1.3 数据的统计与分析

根据记录结果对数据进行反正弦转换后，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，统计分析各处理平均值间的差异性，并用LSD 最小显著差异法比较不同处理间的差异显著性（α＝0.05或α＝0.01）。

2 结果与分析

2.1 枣缩果病菌对2种杀菌剂敏感性

异菌脲和苯甲丙环唑2种药剂的毒力回归方程和有效中浓度分别见表1和表2。由表1和表2可知，CN191、CN192、CN193和CN194这4个菌株对异菌脲和苯甲丙环唑的敏感趋势相同，其中，CN194对这2种药剂的敏感性最强，CN192对这2种药剂的敏感性最差。异菌脲和苯甲丙环唑的处理浓度与抑制效果间均呈正相关，其相关系数分别在0.91和0.94以上。

表1 异菌脲的毒力回归方程和有效中浓度Table1 Virulence regression equations and median effective concentrations of iprodione

表2 苯甲丙环唑的毒力回归方程和有效中浓度Table2 Virulence regression equations and median effective concentrations of benzoyl propiconazole

2.2 突变体菌株的筛选及稳定性

用异菌脲和苯甲丙环唑分别处理CN194，筛选获得能抗0.20 mg·mL-1异菌脲的突变体CN194y。将CN194y接种到无异菌脲的培养基上继代培养5代后，重新接回到含有异菌脲的培养基上，得到稳定的抗异菌脲突变体菌株CN194y。在无异菌脲的PDA培养基上，25 ℃培养5 d后，野生型菌株CN194和突变体菌株CN194y的菌落块直径分别为（5.30±0.07）和（5.30±0.06）cm，二者间无差异。在含有0.20 mg·mL-1异菌脲的PDA培养基上，相同条件下培养5 d后，CN194y菌落块直径为（5.00±0.12）cm，其与在无异菌脲培养基上培养的CN194y的菌落块直径间没有显著差异（P＞0.05）；野生型菌株CN194在含有0.20 mg·mL-1异菌脲的PDA培养基上不能生长。此结果表明，抗异菌脲突变体菌株CN194y的突变特征明显且稳定。

2.3 突变体菌株的致病性

CN194y林间接种后可导致枣果发病（图1A），接种部位出现红褐色凹陷的病斑，果肉病组织呈土黄色海绵状坏死，于成熟前脱落，且与CN194自然状态下致病症状相同（图1B），说明CN194y的致病性没有变化。

2.4 突变体菌株对2种药剂的交互抗性

图1 抗异菌脲突变体菌株CN194y与野生型菌株CN194林间刺伤接种枣果的发病症状Fig.1 Symptoms of jujube fruits inoculated through stab-wound with iprodione-resistant mutant strain CN194y and wild type strain CN194

将抗异菌脲突变体菌株CN194y分别接种在含有不同浓度苯甲丙环唑的培养基上，根据菌落直径测得的毒力回归方程为y＝1.308 4x＋8.865 4，EC50值为0.0011mg·mL-1，其相关系数为0.983 4，与野生型菌株 CN194的 EC50值（0.0013mg·mL-1）间的差异性不显著（P＞0.05）。此结果表明，异菌脲和苯甲丙环唑之间无交互抗性。

2.5 林间喷施2种药剂的防治效果

河北省行唐县寺上村施用过异菌脲和苯甲丙环唑枣园林间防治效果的调查结果见图2。2016年9月2日在发病初期进行第1次调查，异菌脲与苯甲丙环唑的防治效果分别为44.4%和83.3%；同年9月24日发病高峰期进行第2次调查，异菌脲和苯甲丙环唑的防治效果分别为30.8%和51.3%。两次调查结果中，施用苯甲丙环唑与对照间均有显著性差异（P＜0.05），而异菌脲的防治效果与对照间无显著差异（P＞0.05），在施用过异菌脲和苯甲丙环唑的枣园内，苯甲丙环唑的防治效果无论在发病初期还是后期都好于异菌脲。

图2 2016年枣缩果病药剂的防治效果Fig.2 Control effects of fungicides on jujube shrunken-fruit disease in 2016

河北省行唐县寺上村未施用过异菌脲和苯甲丙环唑枣园林间防治效果的调查结果见图3。2017年8月29日在发病初期进行第1次调查，结果表明，异菌脲、苯甲丙环唑和这2种药剂交替施用的防治效果分别为92.9%、57.1%和61.9%，这3种施用方法的防治效果与对照间均有显著性差异（P＜0.05），其中，异菌脲、苯甲丙环唑和这2种药剂交替施用的防治效果间有显著性差异（P＜0.05）。同年9月18日在发病高峰期进行第2次调查，结果表明，异菌脲、苯甲丙环唑和这2种药剂交替施用的防治效果分别为68.4%、47.4%和52.6%，这3种施用方法的防治效果与对照间均有显著性差异（P＜0.05），但3种施用方法的防治效果间的差异性不显著（P＞0.05）。综合来看，在未施用过异菌脲和苯甲丙环唑的枣园内，异菌脲无论在发病初期还是后期都显示有较好的防治效果，且在发病初期的防治效果尤为突出。综合两种试验结果，2种药剂交替施用将有助于避免病菌抗药性的产生。

图 3 2017年枣缩果病药剂防治效果Fig.3 Control effects of fungicides on jujube shrunkenfruit disease in 2017

3 结论与讨论

不同地区枣缩果病初侵染互隔链格孢菌对异菌脲和苯甲丙环唑的敏感性有差异，但敏感趋势相同；互隔链格孢菌对异菌脲易产生抗药性，而对苯甲丙环唑不易产生抗药性，且2种药剂之间不产生交互抗性。虽然林间施药时异菌脲的防治效果好于苯甲丙环唑，但综合室内和林间试验结果来看，长时间单一施用异菌脲会使互隔链格孢菌产生抗药性，且抗性会逐年提升，影响防治效果；而苯甲丙环唑的林间防治效果稳定，且室内未筛选出抗苯甲丙环唑的互隔链格孢菌突变体。因此，林间防治枣缩果病应做好相关监测工作，将异菌脲和苯甲丙环唑交替施用，以延缓病菌抗药性的产生。

调查中发现，在连续施用过异菌脲和苯甲丙环唑的枣园内，异菌脲的防治效果较苯甲丙环唑差；在未施用过这2种药剂的枣园内，异菌脲的防治效果较苯甲丙环唑好，这与王海强[20]和陈帅民[12]的研究结果一致。异菌脲和苯甲丙环唑的防治效果稍逊于邢艺林的防治试验效果[7]，可能是由施药时间推迟了15 d所致。赵乐研究认为，枣缩果病菌可在花期侵入[21]；王森的研究结果表明，枣树花期较长，各品种花期约1～2个月[22]，因此，在初花期施药效果最佳。据李新凤研究报道，向日葵菌核病菌抗腐霉利的突变体菌株仅对同属二甲酞亚胺类杀菌剂的异菌脲有正交互抗性，而对百菌清、多菌灵和福美双等均无交互抗性[16]。本研究结果表明，交替施用2种不同类型的药剂，也不产生交互抗性，这与上述报道的研究结果一致。

异菌脲为二甲酰亚胺类杀菌剂，Orth等认为，此类杀菌剂可诱导菌体产生还原态的氧自由基，从而引起改变细胞膜通透性等一系列破坏细胞的连锁反应[23]。苯甲丙环唑有效成分为丙环唑与苯醚甲环唑，是甾醇脱甲基化抑制剂 ，能够通过抑制细胞壁甾醇的生物合成来阻止真菌的生长[24]，但王海强等人的研究结果表明，二甲酰亚胺类杀菌剂的内吸性较差，抗性风险较高，应作为保护性药剂使用，且尽量与其它类型的药剂轮换使用[20]。在生产实践中，在使用异菌脲防治由链格孢菌引致的病害时，已发现了多个对异菌脲产生抗性的菌株[8-11,13,25-26]；在其它病原菌对杀菌剂的抗性及各杀菌剂间交互抗性的研究报道中，已见有多种杀菌剂易产生抗性的报道，且部分杀菌剂与其它杀菌剂间有正交互抗性[27-29]。本研究未发现链格孢菌对苯甲丙环唑产生抗性。但是，由于杀菌剂的种类较多，每年在枣缩果病发生时，农户盲目用药，有病乱投医现象突出，因此，有必要继续探索与异菌脲作用机理不同的杀菌剂，并进行轮换施用，同时，应对防治枣缩果病的其它杀菌剂进行抗性监测及交互抗性研究，从而为持续控制枣缩果病提供技术支持。

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