大兴安岭16个地区笃斯越桔花粉形态观察

（北京林业大学 林学院，北京 100083）

笃斯越桔Vaccinium uliginosumLinn为杜鹃花科Ericaceae越桔属Vacciniumspp.多年生落叶或常绿灌木型果树[1]，是一种具有极大发展前景的经济树种，其果实富含能清除含有氧化性物质的酚类化合物[2]，具有很高的营养价值。笃斯越桔在中国主要分布于黑龙江、吉林、内蒙古、辽宁等省区[3]，尤其是大小兴安岭地区有着十分丰富的笃斯越桔资源[4]。野生资源是种质创新培育新品种的物质基础，因此大兴安岭丰富的野生笃斯越桔资源是其育种的重要种质资源。花粉形态特征遗传比较稳定，在植物演化和发展过程中，花粉形状、花粉壁纹饰、萌发孔的数目及位置等特征没有明显的变化，环境条件的改变对花粉形态特征的影响较小[5]，能客观反映物种间的关系，研究花粉形态特征对于了解植物的演化、亲缘关系及植物分类都有重要意义。笃斯越桔花粉的生物学特性，不仅是其杂交育种的物质基础，也是其种质鉴定的重要依据之一。

国内外有关杜鹃花科花粉特征的研究主要集中在杜鹃属内，周兰英等[6]和毛加宁等[7]对中国西南地区的杜鹃属花粉进行了观察和比较研究，结果表明，花粉形态特征不宜单独用于种的鉴定，但结合组或亚组的划分、孢粉学特征对种的确定具有一定的指导意义；杨瑞林等[8]对杜鹃花属植物照山白的花粉形态进行了观察，结果表明，照山白不同居群间在花粉形态上存在着差异；Sarwar等[9]研究了40种杜鹃属及其相关属的植物花粉形态，结果表明，孢粉学特征在杜鹃花属的遗传分类中几乎没有作用。然而，有关杜鹃花科越桔属植物的花粉形态的研究报道较少，仅有毛子军等[10]对其作了初步的研究，结果表明，越桔的花粉为四合花粉，外壁纹饰为细网纹状。大兴安岭地区有着十分丰富的笃斯越桔种质资源，然而对于其花粉形态的研究却鲜有报道，因此，本研究对大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉形态进行了观察，对不同地区花粉形态的差异进行分析，对其花粉外壁纹饰的多样化进行了探讨，确定了花粉之间的亲缘关系，以期为其野生种质资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉于2013年6月采集自黑龙江大兴安岭地区，南从加格达奇（N50°17′25.29″、E124°07′10.31″），北至漠河（N53°19′39.37″、E122°09′29.81″）一带的笃斯越桔分布区，途经新林林业局、阿木尔林业局、图强林业局、塔河县等地。该地区年平均降水量458 mm，年均温-2～5 ℃，海拔400～1 000 m；土壤湿润，腐殖质丰富，强酸性，pH值为4.5～5.5。

于笃斯越桔初花期，分别采集16个地区中将要开放或刚刚开放的花30朵，用保温盒低温保存带回实验室，剥出花药，在无风阴凉处干燥，保存于干净的玻璃瓶内，用于花粉形态特征的观测。材料来源信息详见表1。

表1 野生材料来源信息Table 1 The sources of wild materials

1.2 试验方法

采用扫描电镜法[11]进行观察，用双面胶带纸将经自然干燥后的花粉固定于样品台上，经过喷金镀膜后，在扫描电镜下进行观测并拍照。每个样本花粉选取20粒，测定花粉四合体直径和萌发沟长，观察花粉形状、极面观、外壁纹饰等。3次重复。一般而言，花粉直径越大，萌发沟也越长，为了避免四合体直径对萌发沟长的影响，同时对萌发沟的相对长度进行了分析检验，相对长度为萌发沟长与其四合体直径之比[12]。

采用SPSS19.0对16个地区花粉的5个性状指标进行了聚类分析，以判断16个地区笃斯越桔之间的大致亲缘关系。其中，定量性状指标有3个，即萌发沟长、花粉直径、沟长与直径之比，直接取其数值；定性多态性状指标有2个，即花粉壁纹饰、极面观。以不同形态编号为 1，2，……，n，二元性状指标编号为 0，1，采用欧式距离和类平均法进行聚类分析。还对花粉形态和环境条件进行了相关性分析。

2 结果与分析

2.1 大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉的形态特征

大兴安岭16个地区的笃斯越桔的花粉形态特征如图1所示。从图1中可以看出，其花粉均为四合花粉，均呈正四面体排列。极面观1粒在上而3粒在下（图1A）或3粒在上而1粒在下（图1B），赤道面观为2粒在上2粒在下[13]（图1C）。在四合花粉上，相邻花粉粒的孔沟相连，形成6条萌发沟，位于四面体的6条边上，部分孔沟内有清晰的内含物。从极面观正面（图1A）来看，有3条具有内含物的萌发沟；从极面观背面（图1B）来看，有3条无内含物而凹陷的萌发沟。花粉主要为近球形。花粉直径在24.12～39.12 µm之间，沟长在13.86～26.76 µm之间。极面观主要为圆形和三角形。外壁纹饰（图1D）主要有疣状纹饰、颗粒状纹饰、波纹状纹饰等。

大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉形态特征的观测结果见表2。从表2中可以看出，各地区的花粉直径和萌发沟长间均有显著差异，萌发沟的相对长度最大为0.750 6、最小为0.567 2，不同样地花粉的极面观和花粉壁纹饰也不相同。

图1 大兴安岭不同地区笃斯越桔的花粉形态Fig.1 Pollen morphology of Vaccinium uliginosum from different areas of Daxing’anling

表2 16个地区的笃斯越桔花粉形态特征的比较结果†Table 2 The pollen morphology of 16 Vaccinium uliginosum L.

2.2 聚类分析与类群划分

16个地区笃斯越桔的花粉形态特征的聚类分析结果见图2。

在图2中的等级结合线L1处，可将大兴安岭16个不同地区的笃斯越桔花粉形态分为2类：第1类包括样地编号分别为15、16、4、14、3、6这6个地区，第2类包括样地编号分别为11、12、7、8、5、9、10、2、1、13这10个地区。两类的明显区别是，第1类地区的花粉直径（26.62～29.89 µm）平均值均小于30 µm，萌发沟长（16.54～19.98 µm）平均值均小于20 µm；第2类地区的花粉直径（30.74～36.06 µm）平均值均大于30 µm，萌发沟长（20.24～23.63 µm）平均值均大于20 µm。

在图2中的等级结合线L2处，可将大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉形态分为3类：第1类包括样地编号分别为15、16、4、14、3、6这6个地区，第2类包括样地编号分别为11、12这2个地区，第3类包括样地编号分别为7、8、5、9、10、2、1、13这8个地区。这3类地区的划分依据主要是花粉直径和萌发沟长的差异。花粉直径的数据显示：第1类地区的花粉直径范围为26.62～29.89 µm，其平均值是28.56 µm；第2类地区的花粉直径范围为33.70～36.06 µm，其平均值是34.88 µm；第3类地区的花粉直径范围为30.74～34.13 µm，其平均值是32.70 µm。萌发沟长的数据显示：第1类地区的萌发沟长的范围为16.54～19.98 µm，其平均值是17.76 µm；第2类地区的萌发沟长的范围为23.43～23.63 µm，其平均值是23.53 µm；第3类地区的萌发沟长的范围为20.24～21.37 µm，其平均值是20.91 µm。由以上数据比较分析可得，不同类别地区花粉直径的大小顺序为第1类＜第3类＜第2类；不同类别地区花粉萌发沟长的大小顺序为第1类＜第3类＜第2类。花粉直径与萌发沟长的比较分析结果一致，即不同类别地区花粉直径和萌发沟长的大小顺序均为第1类＜第3类＜第2类。

图2 大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉形态特征的聚类分析结果Fig.2 Dendrogram of the Vaccinium uliginosum L by clustering analysis according to the pollen morphology characteristics from 16 areas of Daxing’anling

从图2中的距离系数还可以看出，样地编号分别为15和16的花粉其亲缘关系最近，花粉壁纹饰均为波纹状纹饰，极面观均为圆形；样地编号分别为4和14的花粉其亲缘关系最近，其极面观相同，均为圆形，两者沟长平均值很接近，为18.14（±0.12）µm；样地编号分别为7、8和5的花粉其亲缘关系最近，花粉壁纹饰均为颗粒状纹饰，三者直径平均值很接近31.06（±0.41）µm；样地编号分别为9、10和2的花粉其亲缘关系最近，花粉壁纹饰均为疣状纹饰，极面观均为三角形。

2.3 花粉形态和环境条件的相关性分析

花粉形态指标与生态环境因子的相关性分析结果见表3。从表3中可以看出，笃斯越桔的花粉直径与纬度、海拔、立地类型间有显著或极显著相关性；萌发沟长与经度、立地类型有极显著相关性；相对长度（萌发沟长与花粉直径之比值）与经、纬度间有极显著相关性；花粉壁纹饰与海拔、株高、地径、立地类型间有显著或极显著相关性；极面观与纬度、株高、立地类型间有显著或极显著相关性。综上所述，立地类型是影响花粉形态的主要因素，而株高、地径等苗木形态指标对花粉形态（除了花粉壁纹饰）却无显著影响。

表3 花粉形态指标与生态环境因子的相关性分析结果†Table 3 Correlation coefficients between pollen morphology and ecological factor

3 讨 论

笃斯越桔是杜鹃花科越桔属植物，其花粉为四合花粉，呈正四面体排列、圆角三角形，单粒花粉呈球形或近球形，这一观察结果与前人对杜鹃花科其它属植物花粉形态的研究结果[12-18]较为一致。杜鹃花科的很多种植物其花粉都具有3条孔沟，且花粉表面具有粘丝[14-17]。而沈玉英等[18]的研究结果表明，兔眼越桔的花粉有3对（即6条）孔沟，但花粉表面不具有粘丝，这与本研究观察到的笃斯越桔花粉有6条萌发沟但花粉表面没有粘丝的结果相似。因此推测，花粉表面没有粘丝和6条萌发沟，这是杜鹃花科越桔属植物的特有属性，这一特有属性可以作为鉴别杜鹃花科越桔属植物的一个重要依据。在大兴安岭采集笃斯越桔花粉的地理位置不同，笃斯越桔的花粉在花粉大小、萌发沟长、花粉壁纹饰等方面均有显著差异。一般认为，花粉外壁纹饰结构越复杂，表明其演化水平越高；相反，纹饰越简单，表明其演化水平越低[19]。根据电镜观察发现，部分地区的花粉具有明显的疣状次生纹饰，说明大兴安岭部分地区的笃斯越桔的演化程度高。杜鹃花科植物种类繁多，而已观测的花粉种类极少，本研究得出的越桔属植物花粉形态的特有属性，仅仅是针对目前已经观测了花粉的杜鹃花科植物而言的，因此这一结论还存在一定的局限性，故对笃斯越桔花粉的这一特有属性尚待进一步的研究。

由于花粉性状稳定，不易受到环境因子的影响，在一定程度上能反映出种内亲缘关系的远近[20]，因此，可以从花粉形态的演化规律来探讨笃斯越桔的起源和演化[21]。本文对大兴安岭地区笃斯越桔花粉的聚类分析结果显示：在等级结合线L2处，可将大兴安岭16个不同地理位置的笃斯越桔花粉形态分为3类：第1类包括样地编号分别为15、16、4、14、3、6这6个地区，第2类包括样地编号分别为11、12这2个地区，第3类包括样地编号分别为7、8、5、9、10、2、1、13这8个地区。这3类地区的划分依据主要是花粉直径和萌发沟长的差异。花粉直径与萌发沟长的比较分析结果一致，各类地区花粉直径和萌发沟长平均值的大小顺序均为第1类＜第3类＜第2类。关于花粉大小的演化顺序，目前公认的是，比较原始的被子植物花粉体积都是比较大的，由大到小进化[22]，因此，笃斯越桔花粉演化趋势是第2类地区→第3类地区→第1类地区，同时可以推知，萌发沟的演化趋势是由大到小进化的。从极面观的角度来分类，第1类地区的花粉均是圆形，第2类与第3类的几乎都是三角形；根据极面观可以将16个地区分的花粉分为两类，这一结果与聚类分析结果相同。然而，从花粉壁纹饰演化趋势的角度来进行总体分类，其结果与聚类分析结果却有差异；但是，从两个地区花粉的亲缘关系来看，分析结果与聚类分析结果又一致，亲缘关系最接近的两个地区的花粉壁纹饰相同，因此，根据花粉壁纹饰可以判断其亲缘关系的远近。虽然花粉性状是研究植物分类及品种鉴定的重要依据，但对其花粉还应该结合外观形态学、遗传学、分子生物学等方面的研究结果进行全面的分析。

花粉形态特征的遗传比较稳定[23]，环境条件的改变对花粉形态特征的影响较小，文中的相关性分析结果表明，笃斯越桔苗木的株高、地径等形态指标对花粉形态均无显著影响。立地环境条件是植物生存所需营养物质的直接供给源，决定了植物的生长状况[24]。文中的相关性分析结果还表明，立地类型是影响花粉形态的主要因素。花粉形态特征是由基因控制并在长期进化过程中不断演化而形成的[25]，具有很强的遗传稳定性和保守性，能客观反映物种之间的关系，研究花粉形态特征对于了解植物演化、亲缘关系及对植物分类均有重要意义。

4 小 结

对大兴安岭16个地区的笃斯越桔花粉形态进行了观察研究，结果表明，大兴安岭各地区笃斯越桔花粉在其部分形态特征上保持了一致性，均为四合花粉、具6条萌发沟、呈近球形等。然而，供试样品在花粉的部分形态特征上也表现出了品种的特异性，如花粉大小、萌发沟长、极面观及花粉壁纹饰等，说明大兴安岭地区笃斯越桔种内具有丰富的遗传多样性，可根据花粉形态来区别不同种间的差异及亲缘关系，这可为其遗传育种和引种栽培提供参考依据。

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