不同处理对滇重楼种子萌发的影响

时间：2024-09-03

（中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙 410004）

滇重楼Paris polyphyllavar.yunnanensis（Franch） Hand-Mazz，属百合科Liliaceae重楼属Paris多年生直立草本植物[1-2]，又名七叶一枝花、灯台七、王孙、蚤休等[3]。味苦，性微寒，有微毒，以干燥地下茎入药，活性成分为甾体皂苷[4]，其中，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量被《中国药典》（2010年版）规定为评价重楼品质的重要指标[5]，具有抗肿瘤[6-7]、抑菌抗病毒[8-9]、防治心血管疾病[10]、毒蛇咬伤、肾脏保护[11]、跌扑伤痛、惊风抽搐等多种药理作用，是云南白药、宫血宁、夺命丹等中成药的重要原料[12-13]。茎叶1 a倒苗，全体光滑无毛，株高30～100 cm。且具有越冬期长、营养生长期较短、生殖生长期较长的特点。一般当年11月中下旬倒苗后即进入越冬期，翌年3月萌动，5月从台叶盘上抽薹开花。从5月开花至10月种子成熟，生殖生长期长达5个多月，其营养生长贯穿于生长发育的全过程[14-15]。

近几年，随着对滇重楼药理作用的深入研究，其价值也不断被开发，造成需求量不断攀升，而野生贮藏资源极度缺乏，造成药材原料紧缺。2012年，杨斌等[16]研究表明我国野生滇重楼资源被开发利用的已达到80%，现已被列为云南省30种稀缺濒危天然药物之一。因此，人工种植对缓解滇重楼野生资源就变得尤为重要。又因其宜阴畏晒，喜湿忌燥，惧霜冻和阳光直射，对环境条件适应性较强，荒坡、沟边、林下都可以种植[14]。且近年来，随着我国林权制度的改革，林下种植这种林业复合生产模式在遵守生态优先、因地制宜、可持续发展的原则下也迅速发展起来。而重楼属植物的种子繁殖系数较大，通过种子的有性繁殖结合林下种植方式是获得大量种苗的有效方法，但由于其种子具有“二次休眠”的特性，萌发速度慢，需要经过二次低温处理才能萌发。在自然情况下，滇重楼种子第一年的萌发率较低，大多数种子在来年才进行二次萌发，导致其存在出苗不一致，生长不整齐等问题，影响种子的繁殖效率，造成其在自然条件下年生产量不能满足产业的年消耗量，因此滇重楼种子繁殖技术当前的关键问题是要打破种子休眠，提高种子当年的萌发率。本研究利用不同外源激素和试剂处理滇重楼种子，观察其萌发情况，以找到提高滇重楼种子的萌发速度和萌发率的方法，为滇重楼的产业化规模种植育苗与资源再生提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和仪器

供试材料滇重楼种子购于云南大理，于中南林业科技大学植物学实验室脱去外种皮，置于4 ℃冰箱保存，播种基质为河沙；试验仪器采用KQ-600E型超声波清洗器。

1.2 试验方法

1.2.1 种子千粒质量

随机选取1 000粒去掉外种皮的滇重楼种子，用万分之一的分析天平准确称量，3次重复。同时随机选取100粒种子，利用精确度为0.01 mm的游标卡尺测量种子的长度和宽度，并记录相关数据。

1.2.2 浸种处理

挑选成熟、大小一致、无病害与机械损伤的种子为试验材料，设置不同的激素处理浓度，将种子浸泡在不同的处理溶液中（见表1），均置于24 ℃恒温条件下浸种48 h，然后将种子用纱布打包，放入超声波清洗器40 min、50 ℃、200 W超声波处理[17]。超声波处理结束后，将种子用纯净水反复冲洗干净，取同一处理种子100粒均匀沙藏于托盘中，以纯净水处理相同时间作为对照（CK），每个处理设置3个重复。将经过浸种处理的种子与湿沙按1∶2的体积比混合，并施以种子质量5%的多菌灵可湿性粉剂拌匀杀菌，然后进行二次变温处理2 ℃→20 ℃→4 ℃。

表1 4种试剂的不同处理水平Table 1 Different treatment with four kinds of soaking reagents

1.2.3 数据统计与分析

试验采用萌发率来评价不同试剂处理水平对滇种子萌发的影响。滇重楼种子胚根突破种皮视为萌发，分别于处理后30、40、50、60、90 d观察记录种子的萌发情况测定并记录其最长胚根长度（取每个重复的最长胚根长度再求均值），参考宋发军等[18]的试验方法统计胚根长＞3 cm的种子所占比例。

试验数据采用Microsoft Excel 2007处理，采用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析，结果用（均值±标准差）表示，差异性显著分析采用Duncans检验方法，并设置P＜0.05为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 种子的千粒质量

滇重楼种子多数为卵球形，去除鲜红色的外种皮后，其千粒质量为84.014 6 g，种子平均长度为4.33 mm，种子平均宽度为4.04 mm。

2.2 GA3对滇重楼种子萌发率的影响

50～600 mg/L的GA3浸种处理对滇重楼种子的萌发均存在不同程度的促进作用，见表2。由表2可知，在30～90 d内，随着浓度的增加，萌发率呈先升高后下降的趋势，500 mg/L GA3对滇重楼种子的萌发具有显著的促进作用，90 d时，其萌发率比CK（40.33%）增加了42%，400 mg/L的处理次之，比CK增加了 38.34%。当GA3浓度≥500 mg/L时，萌发率开始下降，但仍然高于CK。结果表明，用GA3对滇重楼的种子进行浸种处理，有利于打破滇重楼种子的二次休眠，大大提高其萌发率与出苗的一致性。

2.3 2,4-D对滇重楼种子萌发率的影响

由表3可知，与CK相比，采用不同浓度的2,4-D溶液浸种预处理滇重楼的种子，30～90 d内，0.2 mg/L与0.4 mg/L的2,4-D浸种能提高滇重楼种子的萌发率，90 d时，分别比CK提高了1.67%与13%。当2,4-D浓度≥0.6 mg/L时，萌发率开始下降，说明高于0.4 mg/L的2,4-D会抑制滇重楼种子的萌发。30～90 d内，1.0 mg/L的2,4-D溶液浸种处理滇重楼种子，其萌发率一直低于CK，在一定程度上促进了种子的再次休眠。

表2 不同GA3浓度对滇重楼种子萌发率的影响†Table 2 Effect of GA3 concentration on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

表3 不同2,4-D浓度对滇重楼种子萌发率的影响Table 3 Effect of 2,4-D concentration on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

2.4 NAA对滇重楼种子萌发率的影响

由表4可知，采用不同浓度NAA溶液浸种后，90 d时，仅有20 mg/L NAA浸种处理组滇重楼种子萌发率比CK高10.34%，其余浓度NAA浸种处理滇重楼种子萌发率均低于CK。当NAA浓度≥40 mg/L时，则不同程度地抑制了种子的萌发，且随着浓度的增加，抑制作用也增强。尤其是浓度为100 mg/L时，萌发率受到严重抑制，萌发率比CK降低了29.66%。由萌发统计数据可知，除20 mg/L NAA溶液浸种对滇重楼种子萌发率具显著的影响，其他浓度均不具显著影响。可见，用高浓度NAA溶液浸种处理滇重楼种子，不利于打破种子的休眠。

表4 不同NAA浓度对滇重楼种子萌发率的影响Table 4 Effect of NAA concentration on seed germination of P.polyphylla var. yunnanensis %

2.5 稀H2SO4处理对滇重楼种子萌发率的影响

从表5可知，利用稀H2SO4浸种处理滇重楼种子，90 d时，稀H2SO4浸种浓度为10%时，滇重楼种子萌发率比CK增加了14.34%，而30%的稀H2SO4浸种对其种子萌发则具有一定的抑制作用，与CK相比，降低了16.66%。由此可知，低浓度（10%）的稀H2SO4浸种处理滇重楼种子可以提高种子的萌发率，高浓度反而抑制其萌发。

2.6 组间优异效果比较

试验结果表明：500 mg/L GA3、0.4 mg/L 2,4-D、20 mg/L NAA、10%的稀H2SO4是4种有效促进种子萌发的预处理方法。90 d时，当GA3浓度为500 mg/L时，滇重楼种子萌发率达到了82.33%；当2,4-D浓度为0.4 mg/L时，萌发率为53.33%；当NAA浓度为20 mg/L时，萌发率为50.67%；当稀H2SO4浓度为10%时，萌发率为54.67%。而30～90 d内，500 mg/L GA3浸种处理滇重楼种子萌发率一直高于CK，由此可见，4种有效提高滇重楼种子萌发率的预处理方法中500 mg/L GA3对滇重楼种子的萌发速度和萌发率的促进作用最显著（见表6）。

表5 不同稀H2SO4浓度对滇重楼种子萌发率的影响Table 5 Effect of dilute H2SO4 concentrations on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

表6 4种试剂最佳浓度浸种对滇重楼种子萌发率的影响比较Table 6 Comparison of four kinds of reagents optimal concentrations of pretreatment on P.polyphylla var. yunnanensis germination of seeds %

此外，从表7可知，在4种有效浸种方式的处理下，500 mg/L GA3对胚根生长具有显著影响，90 d时，其胚根最长长度达到了5.08 cm，比CK（4.15 cm）长0.93 cm，其他几种处理与CK相比并无显著差异（见图1-A）。与此同时，4种试剂最佳浓度浸种胚根长＞3 cm的种子比例分别为68.33%、47.33%、44.33%和36.67%，均高于CK（34.33%），分别高34%、13%、10%和2.34%（见图2），图1- B、C、D、E直观的展示出在第40、50、60、90天时滇重楼种子萌发胚根的生长状况。综上所述，与CK相比，4种试剂浸种均在不同程度上促进滇重楼种子萌发过程中胚根的生长，其中以500 mg/L GA3作用最为显著，且在第126天时，500 mg/L GA3浸种处理的种子最早出苗（见图1-F）。

表7 4 种试剂最佳浓度浸种对滇重楼种子萌发最长胚根长度的影响比较Table 7 Comparison of four kinds reagent concentrations on the longest radicle growth of P.polyphylla var.yunnanensis cm

图1 4种有效处理方式对滇重楼种子胚根生长的影响Fig.1 Effects of four kinds of effective treatments on radicle growth of P.polyphylla var.yunnanensis seeds

图2 4种有效的处理方式下第90天胚根超过3 cm的种子所占比例Fig.2 The percentage of radicle length more than 3 cm of 90-day-grown seeds under four effective treatments

3 结论与讨论

本研究表明，不同试剂浸种处理对打破滇重楼种子萌发具有一定的差异，通过试验结果可以看出：在30～90 d内，综合GA3、2,4-D、NAA、稀H2SO44种外源试剂在一定浓度范围内均能促进滇重楼种子萌发及其胚根生长，其中以500 mg/L的GA3浸种处理的效果最佳，处理90 d后，其萌发率（82.36%）比CK（40.45%）增加了104%，胚根长度（5.08 cm）比CK（4.15 cm）增加了22%。低浓度的NAA、稀H2SO4虽也能促进种子萌发，但本次试验设计的NAA最低浓度为20 mg/L、稀H2SO4最低浓度为10%，在此浓度以下是否还存在着更佳的浓度与关于不同外源试剂如何影响滇重楼种子萌发的机理则还有待进一步研究。

种子休眠是植物具有正常活力的种子萌发的一种适应机制，此时的种子处于适宜的萌发条件而不能正常萌发[19]。但种子休眠期过长会影响植物本身的生产种植，从而降低经济效益，而运用植物外源激素浸种可以破坏妨碍种子萌发的活性物质，打破种子休眠，从而有利于种子的吸水萌发[20]。因此，众多学者围绕着如何打破种子休眠，提高其萌发率做了大量的研究。GA3是打破种子休眠过程中的关键内源信号分子[21]。孔欣然等[22]研究表明：用500 μmol/L 的 GA3对薄皮木种子进行预处理，其发芽率与发芽指数均达到最高值；梁文华等[23]用500 mg/L GA3浸种狭叶薰衣草种子24 h，也得出与其一致的结论。李永红等[24]发现NAA浓度为10 mg/L处理大果蔷薇种子时发芽率最高，可达53.6%，低于或高于此浓度均会抑制其种子萌发。2,4-D能影响细胞的分裂、伸长、分化。NAA可促进细胞分裂，扩大、诱导形成不定根，促进新陈代谢和光合作用，加速生长发育，增加坐果[25]。还有研究表明，内源激素含量不仅影响种子萌发，在茄子雄性不育和单性结实的发生中也起着重要作用[26]。而本文中滇重楼种子萌发与内源激素含量的关系如何则需要进一步研究。稀H2SO4由于其中的硫酸分子已经被完全电离，虽然不具有浓H2SO4的脱水性（俗称炭化，即强腐蚀性），但适当浓度的稀H2SO4浸种预处理种子可软化其种皮。而滇重楼的种子萌发在生产育苗中，若不能找到有效的方法打破其种子的“二次休眠”，则会在自然情况下出现出苗周期长、萌发率低等情况。为此，王艳芳等[27]研究发现在最低温度高于10 ℃的冬季用600 mg/L的GA3撒播可使滇重楼种子的出苗时间缩短至5个月左右，且出苗率可达50%以上；李宝等[28]研究表明在20 ℃恒温下培养滇重楼种子，其萌发率100 d后可达98.89%；徐文娟[29]研究表明GA、FL、ACC与6-KT均能在一定浓度范围内促进滇重楼种子的萌发。且用不同外源激素处理种子萌发时，不同处理浓度、时间与温度通常会对处理效果产生影响，薛婷婷等[30]以核桃种子为材料研究发现种仁的生理代谢对温度的响应会影响种子的萌发率。而本研究仅在单因素下分析了滇重楼种子的萌发与胚根生长情况，存在一定的局限性，因此可运用此研究的最优处理结合不同处理温度、时间、与贮藏方式等多因素做进一步研究，并探究在不同处理下最优处理的种子萌发生理与内源激素等变化，为滇重楼种子的萌发提供理论依据。

从长远来看，许多药用植物产业生产中种子繁殖是最为经济有效的方法，但种子休眠亦是药用植物存在的一种常见现象，因而只有不断地探索出有利于打破种子休眠的试剂与合适浓度，才能更好地解决目前中药材供求矛盾，同时也是保护野生资源的最佳途径。

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