井冈山地区铁皮石斛的繁殖生物学研究

曾建军,王路平，武忆雯

井冈山地区铁皮石斛的繁殖生物学研究

*曾建军,王路平，武忆雯

（井冈山大学生命科学学院，江西，吉安 343009）

通过野外实验观察和人工控制套袋等方法，从铁皮石斛的花部基本特征、开花动态、花粉活力、柱头可授性、杂交指数、套袋实验等方面对其繁殖生物学进行了研究。结果显示：（1）井冈山地区铁皮石斛4~6月开花，种群花期近60 d，多数花（50%）在约30 d内开放，果实一般需要180 d左右才能成熟。（2）铁皮石斛花粉活力开花后24 h即可达到（62.67 ± 6.43）%，至开花第三天，活力可达到90%，柱头可授性达到最高，至第5天柱头仍保持高可授性。（3）套袋实验表明，部分自交亲和，异交，需要传粉者。自然条件下未观察到井冈山铁皮石斛居群结实，人工自花授粉率为22.2%。该研究结果为保护和利用井冈山铁皮石斛种质资源提供了科学依据。

单宁；井冈山地区；铁皮石斛；花部综合特征；繁育系统

铁皮石斛()为兰科(Orchidaceae)石斛属()药用植物之一，具有益胃生津、滋阴清热、增强免疫力、抗肿瘤等功效[1]。由于铁皮石斛对生长环境要求苛刻、植株繁殖力低、生长缓慢及人为过度采挖，野生铁皮石斛资源已近枯竭[2]。目前，人工规模化种植铁皮石斛技术已比较成熟，满足了人们对铁皮石斛日益增长的需求。在铁皮石斛种植产业中，优良品种的选育是人工种植铁皮石斛产业的关键[3]，而丰富的种质资源是优良品种选育的基础。我国铁皮石斛种质资源十分丰富，野生铁皮石斛有36个品种 2 个变种，为优良品种的选育提供了丰富的资源[4]。然而，不同地域来源的植物种质资源繁育特性差异较大，因此，开展不同地域铁皮石斛野生种质繁育系统研究，可为铁皮石斛资源保护和品种选育提供科学依据。

目前，铁皮石斛的研究主要集中在种质资源组分、基因组学、种苗快繁、栽培等方面[3]，关于繁殖生物学方面的研究仍不足。何平荣等[5]对丹霞地貌生境中铁皮石斛的克隆繁殖特性、开花物候等繁殖生物学进行了初步研究，朱波等[6]研究了温室大棚设施下铁皮石斛花粉活力与杂交授粉技术，但缺乏对开花动态、花部结构、柱头可授性等繁殖特征系统深入的研究。

江西省吉安市井冈山地处南岭山地，向北延伸至湘赣边境的罗霄山脉中段，土壤以山地黄壤为主，土层厚度一般在50~80 cm，土质疏松、肥沃、湿润。属亚热带湿润山地季风气候。井冈山独特的地理环境和优越的气候条件孕育了繁多的野生植物资源[7]，其中铁皮石斛为井冈山珍贵的野生药用资源之一[2,8]。为了更好地保护和利用井冈山地区铁皮石斛种质资源，本研究从花部基本特征、开花动态、花粉活力、柱头可授性、杂交指数、套袋实验等方面对井冈山野生铁皮石斛繁殖生物学特征进行了探讨，以期为其资源保护以及繁育利用提供理论依据。

1 研究样地与研究方法

1.1 研究样地

井冈山地区位于江西省中部，地理坐标为26°27′~26°40′N、113°39′~114°23′E，总面积70847 hm2，年平均气温14.2 ℃，降雨量1 866 mm，年均日照时长达1365.5 h。

野生铁皮石斛2012年采集于井冈山五马朝天，经组织培养扩繁后，2015年种植于大井20年以上树龄的湿地松林内，研究样地约200丛铁皮石斛。

1.2 研究方法

1.2.1 开花动态及花部形态特征测定

2017年4月29日为研究样地铁皮石斛种群始花期，5月份对种群不同植株标记花（30~50朵）进行观察。每天观察花蕾直到花蕾开放，并测量正开放花苞片长、花苞片宽、中萼片长、中萼片宽、合萼片长、合萼片宽、左侧花瓣长、合蕊柱至唇瓣距离、唇瓣至萼片根部的距离、花梗的长度等花部形态指标，记录从开花到结果期的形态变化、发育所经历的时间等。

1.2.2 花粉活力与柱头可授性检测

花粉活力的测定采用TTC法，柱头可授性的测定采用联苯胺－过氧化氢法[9]。随机标记即将开放的花蕾60朵，每隔24 h检测1次花粉活力，直至花朵凋谢为止。同时，将检测花朵的柱头浸入凹面载片中含有联苯胺－过氧化氢反应液的凹陷处检测柱头可授性。若柱头具可授性，则柱头周围的反应液呈现蓝色并有气泡出现。

1.2.3 杂交指数（OCI）估算

按照Dafni[10]的方法进行花直径和开花行为的测量及繁育系统的判断。具体方法：（1）花朵或花序直径< 1 mm记为0，1~2 mm记为1，2~6 mm记为2，> 6 mm记为3；（2）花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔，同时，雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1。三者之间和为OCI值。OCI = 0时，繁育系统为闭花受精；OCI = 1时，繁育系统为专性自交；OCI = 2时，繁育系统为兼性自交；OCI = 3时，繁育系统为自交亲和；OCI=4时，繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。

1.2.4 套袋实验

在铁皮石斛开花前期，选20个植株，每个植株上标记6朵即将开放的花为1组，将每组中的6朵花分别进行以下6种处理：（1）对照：不去雄、不套袋、自由传粉，用于检测自然条件下的传粉率；（2）开花前套袋、不采取任何措施，用于检测是否自交亲和；（3）去雄、套袋，人工进行同株自花传粉，用于检测能否同株自花授粉；（4）套袋、去雄、用不同无性系植株的花粉进行异花传粉，用于检测是否异交亲和；（5）套袋、去雄、不授粉，用于检测无融合生殖。

1.3 数据分析

数据均用 Excel 和 SPSS19.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 开花动态及花部基本特征

井冈山地区铁皮石斛花期近60 d（从2017年4月29日至2017年6月26日），但多数花（50%）在约30 d内开放。铁皮石斛茎长15 cm左右不等，依靠浅根着生，根系裸露，横向伸长范围较大，但伸展长度不均匀。单花序有花4~5朵不等，花较大，每苞片内着生花1朵，俯垂，单花三枚萼片（1中萼片，2合萼片），花在开放期间花萼片由深绿变为浅绿再变为黄绿，萼片底端先展开，顶部再展开。花瓣2枚，唇瓣底端为黄绿色，中间为紫红色，下垂的顶端为白色，雄蕊和雌蕊称为合蕊柱，表面基部有紫色斑点，合蕊柱中，雄蕊在上，花帽里有两块花粉团。果实一般需要180 d左右才能成熟。

表1 铁皮石斛种群开花进程和花形态特征

铁皮石斛花部基本特征花苞片长、花苞片宽、中萼片长、中萼片宽、合萼片长、合萼片宽、左侧花瓣长、合蕊柱至唇瓣距离、唇瓣至萼片根部的距离、花梗的长度等形态学指标的统计分析，结果见表2。所有指标经过非参数K-S检验，上述各指标的相伴概率均大于0.05，表明各指标在个体水平上均没有显著差异。

表2 铁皮石斛花部基本特征 (平均值±标准偏差)

2.2 花粉活力与柱头可授性检测

检测结果表明，铁皮石斛花粉活力开花后24 h即可达到（62.67 ± 6.43）%，至开花第3 d，活力可达到90%，柱头可授性达到最高。到开花第4 d花粉活力开始下降，但至第5 d柱头可授性仍保持较高可授性。至开花第8 d，花粉活力下降至50%以下，柱头可授性逐步下降。至第10 d，花粉活力和柱头可授性基本丧失。

表3 铁皮石斛花粉活力与柱头可授性检测结果 (平均数±标准误差)

注：-表示柱头不具可授性；+表示柱头具可授性；++表示柱头可授性强；+++表示柱头可授性最强。

2.3 杂交指数

铁皮石斛花朵直径 > 6 mm，记为3；雄蕊比雌蕊先熟，记为1；花药在柱头之上，空间分离，记为1。三者累计所得值为5，即OCI值为5。根据Dafhi[13]建议的标准，铁皮石斛的繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。

2.3 套袋实验

套袋和人工授粉实验结果见表4。自然条件下未观察到井冈山铁皮石斛居群结实，套袋不采取任何措施结实率也为0，但套袋去雄后人工进行同株自花传粉，结实率达22.2%，这说明铁皮石斛不存在自动的自花授粉，必须通过一定的媒介传粉才能实现繁衍后代。去雄套袋处理的结实率为0，说明铁皮石斛不存在无融合生殖。套袋后去雄，用不同无性系植株的花粉进行异花传粉，结实率为56.25%，表明铁皮石斛繁育系统为自交、异交亲和，以异交为主，需要传粉者。

表4 铁皮石斛套袋实验

3 讨论

兰科石斛属的大多数植物是自交不亲和的，异交才是该属物种主要有性繁殖机制[11]。本研究表明铁皮石斛繁育系统以异交为主，需要传粉者，但也存在部分自交亲和现象。自交在克服传粉媒介的短缺、维持种群的局部适应方面也有许多优势[12]。井冈山地区铁皮石斛自交亲和特征对其种群的维持具有一定的意义，但本研究中未发现自交亲和结实现象，推测井冈山地区铁皮石斛自交亲和比例非常低。不同地域来源铁皮石斛的自交结实率差异较大，朱波等[6]收集的云南、浙江等地铁皮石斛自交结实率为7.3%，王聪等[13]研究的铁皮石斛 TD2、H1等8个种质的自花授粉座果率在11.8%~36.4%之间，其中TX3 种质的自花授粉座果率可高达 90.0%。本研究表明，井冈山野生铁皮石斛自花授粉率为22.2%。了解不同种质资源铁皮石斛繁育特性可为新品种选育的提供理论依据。

在自然条件下，铁皮石斛结实率很低[1]。本研究也未观察到井冈山铁皮石斛自然居群结实现象。花粉活力研究表明，井冈山铁皮石斛在开花7 d内花粉活力仍可保持在50%以上，说明其花粉质量不存在严重缺陷，花粉质量可能不是导致铁皮石斛自然结实率低的主要原因。植物花部构成和开花式样综合作用影响对传粉者吸引和花粉的散布[14-16]。兰科植物无叶美冠兰（）主要传粉昆虫是绿彩带蜂(Cockerell)，其冠兰花型较大，花平均花合萼片宽（入口宽）6.84 mm和合蕊柱至唇瓣距离（入口高）2.33 mm[17]。井冈山铁皮石斛花入口宽平均7.81 mm、入口高平均2.81 mm，与无叶美冠兰花大小相近，但是在观测地研究期间，并未观察到任何传粉昆虫访问。林爱英[18]研究了福建野生细茎石斛()花传粉通道，入口宽为6.74 mm、入口高为4 mm，花型属较大型，但野外也未观察到传粉昆虫。推测井冈山铁皮石斛和福建野生细茎石斛研究样地为山区，同期开花植物不足，传粉媒介食源缺乏，影响传粉昆虫的生存、活动。除此外，井冈山地区铁皮石斛种群集中开花主要集中在5月底约30 d时间，单花开放较集中的这个特性对于增加昆虫的访花行为、保证其有足够的时间完成传粉受精不利。集中大量开花是植物吸引传粉昆虫主要手段之一。因此，传粉媒介缺乏是井冈山地区铁皮石斛自然条件下未结实的主要原因。

人工辅助授粉技术的应用，使铁皮石斛座果率低的问题得到有效解决[5]。井冈山铁皮石斛开花当日合蕊柱的柱头即具有可授性，开花第2 d至第5 d，柱头可授性保持在90%以上，可授性持续期可达9 d左右。综上，井冈山野生铁皮石斛开花后3~4 d内进行授粉结实率最高，这与李景蕻等[19]研究不同授粉方式对铁皮石斛蒴果发育结果一致。目前，匮乏的铁皮石斛野生种质资源已很难支撑优良品种的选育，通过对不同地理来源铁皮石斛繁殖生物学的研究，可以为保护和利用铁皮石斛资源提供一定的理论基础。

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Reproductive Biology ofin Mount Jinggangshan region

*ZENG Jian-jun, WANG Lu-ping, WU Yi-wen

(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To reveal the reproductive biology ofin mount Jinggangshan region, the reproductive traits such as floral basic characteristics, phenology of flowering, pollen viability, stigma receptivity, out-crossing index and emasculation were investigated by the methods of experimental observation and bagging treatment. The results showed that: (1)flowered during April to July , and the lifespan of population was about 60 days. Most of flowers (above 50%) bloomed within 30 days and the time for fruits maturity was about 180 days; (2) pollen viability ofcould reach (62.67 ± 6.43)% after flowering 24 hours, it reached 90% and stigma receptivity was the highest after flowering 3 days, stigma receptivity maintained highest receptivity from the third to fifth day; (3)was compatible partly, outcrossing, it need visiting insects. However, we did not observe fruits in Jinggangshan natural region, and the maturing number was only 22.2% when bagged with emasculation and artificial xenogamy were performed in the same plant. It is obvious that, above results provide scientific basis for the protection and utilization ofin Jinggangshan region.

Mount Jinggangshan region;; floral symdrome; reproductive system

Q945.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.05.005

1674-8085(2019)05-0021-05

2019-03-11；

2019-05-21

江西省科技支撑计划项目（20161BBF60073；20161BBF60064）

*曾建军(1973-），女，江西吉安人，副教授，博士，主要从事植物生态学方向的研究(mail: 764178121@qq.com);

王路平(1998-），女，安徽阜阳人，井冈山大学生命科学学院生物学教育专业2016级本科生(mail: 350487545@qq.com);

武忆雯(1996-），女，山西运城人，井冈山大学生命科学学院生物学教育专业2016级本科生(mail: 941884407@qq.com).