巴中产栀子对大鼠肝损伤模型保肝降酶药理效应研究

王利国，唐 灿



巴中产栀子对大鼠肝损伤模型保肝降酶药理效应研究

王利国1，*唐 灿2

（1.泸州医学院附属中医医院，四川，泸州 646000； 2.泸州医学院药学院，四川，泸州 646000）

目的 研究巴中产栀子对大鼠肝损伤模型保肝降酶药理效应。方法 采用大鼠皮下注射四氯化碳(CCl4)制备肝损伤模型、分别灌胃给予栀子水溶性有效部位、70%醇溶性有效部位，速率法测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)，观察巴中、湖北、江西和江津产栀子对CCl4导致的大鼠肝损伤模型降低AST和ALT作用。结果 四个产地栀子无论是水溶性有效部位，还是70%醇溶性有效部位均具有非常显著的降低AST和ALT作用（与肝损伤模型组Model比较，分别为＜0.001＜0.01＜0.02＜0.01）；栀子水溶性有效部位比70%醇溶性有效部位降低AST、ALT的效果更好，但是无显著性差异（＞0.05）。巴中产栀子提取物降低AST、ALT效果比江西、湖北、江津产栀子更好（尤其水溶性有效部位），巴中产栀子水溶性有效部位对肝损伤大鼠AST活性降低作用显著优于江津产栀子水溶性有效部位（＜），非常显著优于湖北产栀子水溶性有效部位（＜0.01），极显著优于江西产栀子水溶性有效部位（＜）；巴中产栀子水溶性有效部位降低ALT作用与湖北、江西、江津产栀子比较有进一步降低的趋势，但是无显著的差异（＞）；巴中产栀子70%醇溶性有效部位降低AST、ALT作用比江西、湖北、江津产栀子更有优势，但是无显著性差异（＞）。结论 根据栀子对大鼠CCl4肝损伤模型保肝降酶效应研究结果证明巴中产栀子的品质更优、疗效更佳。巴中产栀子作为川产道地药材的开发研究值得各级政府和社会各界的广泛关注。

巴中产栀子；肝损伤模型；保肝降酶效应；AST；ALT

栀子为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，主产于四川、湖北、江西、重庆、浙江、湖南、福建等省[1]，具有泻火除烦、清热凉血解毒之功效，适用于热病心烦，黄疸尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡等证[2]，临床配方应用与中成药配伍制药十分广泛。现代药理研究证明栀子具有显著的保肝降酶、利胆退黄、解热抗炎、抗病原微生物等药理作用。我们课题组曾报道巴中产栀子主要有效成分—栀子苷、西红花苷Ⅰ、熊果酸含量均远远高于其它产地栀子相应有效成分含量，从主要有效成分含量方面初步证明巴中产栀子品质优异、质量稳定[3]。要真正建立一个品质优异的川产道地药材—巴中产栀子，仅有上述报道检测主要有效成分含量还远远不够，还必须通过主要药效学指标将巴中产栀子与湖北、江西、重庆等地产栀子的药理效应横向比较，以明确巴中产栀子的药理效应强弱，进一步从药理效应方面证明巴中产栀子的优异品质。我们课题组首先抓住栀子主要药效学指标之一的保肝降酶效应进行以下研究[4]，其它主要药效学指标研究论文将另文报道。

1 材料

1.1 药物与试剂

巴中产栀子成熟果实采自巴中市巴州区平梁乡青包山村——四川省栀子产业科技示范园区，四川省巴中市百顺中药饮片有限公司负责种植的30年生栀子。湖北产栀子成熟果实采自湖北省枣阳市新市镇；江西产栀子成熟果实采自江西省抚州市金溪县黄栀子GAP种植基地；江津产栀子采自重庆市江津区贾嗣镇红阳村。四产地栀子均分别采用两种相同的提取工艺参数提取有效部位[5-6]。栀子水溶性有效部位0.3 g/mL，栀子70%乙醇溶性有效部位0.3 g/mL（提取物中乙醇已除尽）。70%乙醇采用95%食品级乙醇稀释而成。四氯化碳CCl4（分析纯）购于天津奥然化学试剂有限公司，天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒AST（液体单试剂）、丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒ALT（液体单试剂）均购于上海复星长征医学科学有限公司。

1.2 仪器

BECKMAN DXC800 AUTOMATIC ANALYZER、HC-2062高速离心机。

1.3 动物

S.D大鼠，雌雄兼用，150~180 g。由重庆滕鑫生物有限公司实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2012-0006。

1.4 统计学处理

2 方法与结果

2.1 试验方法

实验动物分为10组：肝损伤模型对照组Model、正常对照组Normal；给药8个组细分为：巴中产栀子水溶性有效部位组BZZZW、江西产栀子水溶性有效部位组JXZZW、江津产栀子水溶性有效部位组JJZZW、湖北产栀子水溶性有效部位组HBZZW；巴中产栀子70%醇溶性有效部位组BZZZA、江西产栀子70%醇溶性有效部位组JXZZA、江津产栀子70%醇溶性有效部位组JJZZA、湖北产栀子70%醇溶性有效部位组HBZZA。每组动物数均为10只。于实验第1 d肝损伤对照组、给药8个组大鼠均皮下注射CCl45 mL/kg体重。于实验第2 d给药8个组分别开始灌胃给予相应药物，剂量均为1.6 g/kg；Model、Normal组灌胃给予等量生理盐水。每天灌胃1次，连续6 d。试验第7 d大鼠眼眶取血[7]，取血清测定AST和ALT。

2.2 检测原理

肝坏死、肝损伤或导致肝脏疾病有关因素通常致使AST、ALT从细胞内释放进入血液而引起血清或血浆中AST、ALT水平升高。本试剂盒以国际临床化学联合会IFCC推荐方法为基础，不含磷酸吡哆醛，所采用的反应原理与反应式参照文献[8-10]，具体内容从略。

2.3 试验结果

结果见表1。

表1 栀子对保肝和降酶的影响(，n = 10)

Table 1 Effect of insurancing liver＆dropping enzyme in gardeniae fructus

表1 栀子对保肝和降酶的影响(，n = 10)

groupDose(g/kg)ASTALT Normal—174.50 ± 33.8447.75 ± 9.84 Model—299.00 ± 123.05※※140.00 ± 43.31※※※ BZZZW1.6116.00 ± 32.32△△△35.50 ± 13.35△△△ JXZZW1.6161.67 ± 17.28△△○○○46.00 ± 11.64△△ JJZZW1.6156.80 ± 7.92△△○○44.20 ± 11.63△△ HBZZW1.6168.75 ± 46.09△△○○42.13 ± 8.27△△ BZZZA1.6158.00 ± 36.37△△46.86 ± 5.15△△ JXZZA1.6183.00 ± 47.71△45.25 ± 11.93△△ JJZZA1.6178.17 ± 30.64△△53.50 ± 15.76△△ HBZZA1.6156.33 ± 47.03△△43.50 ± 11.90△△

注：与Normal组比较※＜，※※＜，※※※＜

与Model组比较△＜，△△＜，△△△＜

与BZZZW组比较○＜0.05，○○＜0.01，○○○＜0.001

由表1可知，肝损伤模型组Model大鼠AST、ALT活性均极显著高于正常对照组Normal大鼠(分别为＜0.01、＜0.001），表明用CCl4皮下注射大鼠制备肝损伤模型成功。巴中、江西、江津、湖北四个产地的栀子提取物对肝损伤模型大鼠AST、ALT活性均具有非常显著的降低作用（与肝损伤模型组Model比较，分别为＜0.001、＜0.01、＜0.02、＜0.01），证明本研究方法、药物提取方法、主要药效学指标确定、给药方法选择是可行的[11]。

巴中产栀子水溶性有效部位BZZZW对肝损伤大鼠AST活性降低作用明显优于江津产栀子水溶性有效部位（＜0.05），明显优于湖北产栀子水溶性有效部位（＜0.01），明显优于江西产栀子水溶性有效部位（＜0.001）；巴中产栀子水溶性有效部位对肝损伤大鼠ALT降低作用优于湖北、江西、江津产栀子水溶性有效部位，但是无统计学意义（＜0.05）。

巴中产栀子70%醇溶性有效部位BZZZA对肝损伤大鼠AST、ALT活性降低作用比江西、湖北、江津产栀子70%醇溶性有效部位更有优势，但是无显著性差异（＜0.05）。

栀子水溶性有效部位对肝损伤大鼠AST、ALT活性降低作用优于70%醇溶性有效部位，但是无显著性差异（＜0.05）。

总之，从栀子对大鼠CCl4肝损伤模型降低AST、ALT活性的研究结果证明巴中产栀子的品质更优、疗效更佳，巴中产栀子作为川产道地药材的开发研究值得各级政府和社会各界的广泛关注。

3 讨论

3.1 巴中产栀子的临床效果比较分析

尽管我们课题组前期报道巴中产栀子主要有效成分栀子苷、西红花苷I、熊果酸含量均非常显著高于湖北、江西、江津产栀子，但是本研究发现有效成分的含量高低与保肝降酶的效应并不呈现明显的相关性，巴中产栀子降低AST效应显著优于湖北、江西、江津产栀子，而降低ALT效应与湖北、江西、江津产栀子比较并无显著优势，表明中药的量效关系的复杂性和无规律性[12]。预示一方面可以减少巴中产栀子的用量即可达到同样的疗效，达到减少药材资源浪费，有利于中医药可持续发展的目的；另一方面根据传统的炮制经验，临床配方用栀子多采用烘干、麸炒、清炒等方法进行炮制后才能入药[13]。依据本研究成果，预示巴中产栀子可更有效抵抗在烘干、麸炒、清炒等炮制过程中有效成分受热破坏而致疗效降低的风险。这些都有待进一步立项研究。

3.2 进一步探讨栀子的保肝降酶作用机制

本研究目前只对栀子提取物对肝损伤大鼠AST、ALT活性进行研究，似对了解栀子是如何保肝降酶的机制还不够深入。下一步有待采用肉眼、光镜和电镜观察。肉眼观察、组间比对大鼠肝脏体积、色泽、质地有无异常。将肝损伤大鼠的肝脏取出，用10%福尔马林固定，送病理切片检查。在光镜下HE染色观察肝细胞排列正常与否、有无肿胀及脂肪变性、有无炎性细胞浸润或纤维结缔组织增生；脂肪染色、糖原染色计算大鼠肝脏平均灰度、阳性率[14]；在电镜下观察受损肝脏亚显微结构改变情况，观察肝脏星状细胞增殖状况，肝细胞线粒体形态改变状况，肝细胞线粒体ATP合成改变状况[15-16]。只有这样才能较直观、较深入准确了解栀子保护肝脏的作用机制[17-18]，更有待进一步立项研究。

参考文献：

[1] 徐国均. 中草药彩色图谱[M]. 福州:福建科学技术出版社, 1989: 44.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社, 2010: 231.

[3] 唐灿,王子雯,孙嘉婧. 多指标综合评价巴中产栀子的品质[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(24): 115.

[4] Murray R L. Alanine aminotransferase[M]. 2nd ed. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, and Correlation, Kaplan LA, Pesce AJ, eds. St. Louis: The CV Mosby Company, 1989: 895-898.

[5] 孙嘉婧,唐灿,王子雯.多指标综合考察巴中产栀子提取工艺[J].中国医院药学杂志, 2012, 32(4): 255.

[6] 陈红,唐灿,黄锐.优选栀子提取工艺[J]. 泸州医学院学报, 2011, 34(1): 36.

[7] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社, 1993: 832

[8] 中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社, 2006.

[9] Zilva, J F, Pannall P R .Plasma enzymes in diagnosis in clinical chmistry in diagnosis and treatment[M]. London: LLoyd-Luke, 1979: 338.

[10] IFCC. Expert Panel on enzymes Part 3[J].J.Clin. Chem. Cli. Biochem,1986,24:481-495.

[11] 王子雯,唐灿,孙嘉婧.多指标综合评判巴中产栀子的采收期和生长期[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(9):554.

[12] 唐灿,张彦燕,李云鹏,等.高效液相色谱法测定巴中栀子熊果酸含量[J].四川中医, 2008, 26(4):44.

[13] 黄锐,唐灿,姚健,等.栀子果实干燥工艺优选研究[J].中国实验方剂学杂志, 2011,17(7): 37.

[14] 孙建光,高继龙.补肾化浊方对非酒精性脂肪肝大鼠血清瘦素与胰岛素抵抗的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2012, 18(24):288.

[15] Wallnofer H, Schmidt E, Schmidt F W. Synopsis der Leberkranlcheiten Georg[J]. Dtsch. med Wschr,1974: 99: 343.

[16] Tictz N W. Blood gases and electrolytes in fundamentals of clinical chmistry[M]. Phildelphia: Tietz NW(Ed)WB Saunders Company ,1976: 941.

[17] 袁建,杨宇.基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶抑制剂-1与肝纤维化的中医治疗[J].井冈山大学学报:自然科学版,2010,31(5):106-109.

[18] 张四青,钟树妹,郭经琴.非酒精性脂肪肝患者的胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的临床研究[J].井冈山大学学报:自然科学版,2010,31(5):125-129.

PHARMACOLOGICAL EFFECT OF LIVER PROTECTION AND ENZYME REDUCTION OF GARDENIAE FRUCTUS FROM BAZHONG IN RAT LIVER DAMAGE MODEL

WANG Li-guo1,*TANG Can2

(1.Affiliated TCM Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000,China; 2. Pharmacy School of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000,China)

Objective:To explore the pharmacological effect of liver protection and enzyme reduction of gardeniae fructus from Bazhong in rat liver damage model.Methods: Preparing rat liver injury model by subcutaneous injection of CCl4, administrating with water extraction and 70% ethanol extraction of gardeniae fructus by intragastric, respectively, determing the activity of AST and ALT by rate method,the reduced activity of AST and ALT on rats with damage liver by CCl4of gardenia fructus from Bazhong, Hubei, Jiangxi and Jiangjin were investigated. Results: Water or 70% alcohol extraction of gardenia from Bazhong, Hubei, Jiangxi and Jiangjin could significantly reduce the activity of AST and ALT (comparing with model group,＜0.001,＜0.01,＜0.02,＜ 0.01, respectively); Water extraction was better than 70% ethanol extraction,but no significant difference (> 0.05).The effect of extraction in gardenia from Bazhong that reduced activity of AST and ALT was significantly better than those from Jiangxi, Hubei, and Jiangjin (special for water extraction). The effect of water extraction in gardenia from Bazhong that reduced activity of AST was significantly better than that from Jiangjin (＜ 0.05), highly significantly better than that from Hubei (＜ 0.01), extremely better than that from Jiangxi (＜ 0.001). The effect of water extraction in gardenia from Bazhong that reduced activity of ALT was better than that from Jiangjin, Hubei Jiangxi, but no significant difference (＞ 0.05). The effect of 70% ethanol extraction in gardenia from Bazhong that reduced activity of AST and ALT was better than that from Jiangjin, Hubei Jiangxi, but no significant difference (＞ 0.05). Conclusion: Quality of gardeniae fructus from Bazhong is better than from Jiangxi, Hubei, and Jiangjin, gardeniae fructus from Bazhong is well worth focusing by government and society.

from Bazhong; liver damage model; effect of liver protection and enzyme reduction; AST; ALT

1674-8085(2015)01-0091-04

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.019

2014-10-10；修改日期：2014-12-22

四川省科技厅-泸州市政府-泸州医学院三方联合专项 (14ZC0045)；四川省科技支撑计划项目 (2010SZ0049；2011SZ0048)；泸州市政府-泸州医学院联合专项（2013LZLY-K69）；四川省教育厅重点科研项目 (2005A071)

王利国(1969-)，女，四川泸州人，主管药剂师，执业药师，主要从事临床药学工作(E-mail:tsswlg@163.com);

*唐 灿(1967-)，男，四川广安人，教授，硕士生导师，执业药师，主要从事中药科学研究工作(E-mail:Tang9670625@163.com).